动物细胞工程

动物细胞工程常用技术：动物细胞培养

细胞核移植

动物细胞融合单克隆抗体的制备

其中动物细胞的培养，是动物细胞工程的基础，也即动物细胞培养是细胞核移植，动物细胞培养，单克隆抗体的制备的基础。

动物细胞培养

1.概念：就是从动物机体中取出相关组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。

2.原理：细胞增殖

3.动物细胞培养过程

动物组织块

剪碎组织

用胰蛋白酶处理

分散成单个细胞

制成细胞悬液

原代培养

原代培养

4.细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，（单层）

要求：培养瓶（皿）内表面光滑无毒易于贴附。

接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着有丝分裂，数量不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

原代培养：动物组织消化后的初次培养称为原代培养。

特点：10代以内，能保持正常的二倍体核型。

目前使用或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型。

传代培养：原代培养接触抑制时用胰蛋白酶处理后的分瓶培养称之为传代培养。

细胞株：10-50代，遗传物质没有发生改变

细胞系：50代后，遗传物质发生改变

5.细胞培养条件

（1）

无菌，无毒

无菌：添加抗生素

无毒:定期更换培养，以便清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。

（2）

营养

糖，促生长因子，无机盐，氨基酸，血清，血浆，微量元素

加入血清，血浆的目的：血清，血浆可以补充培养基中缺乏的物质。

（3）

温度，pH

温度：36.5+0.5

pH：7.2-74

（4）

气体环境

95%空气加5%CO2

O2是细胞代谢所必须的CO2主要作用是维持培养液pH

6.动物细胞培养与植物组织培养的培养基相比其特点是：

动物细胞培养：液体培养基，含有血清和血浆

植物细胞培养：固体培养基，含有植物激素

动物细胞核移植技术与克隆动物

1.概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成新的个体。

核移植的方法得到的动物称为克隆动物

原理：动物细胞核具有全能性

2.核移植分类

胚胎细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易

体细胞核移植：细胞分化程度高，恢复全能性不容易

3.体细胞核移植过程

（1）供体细胞：10代以内细胞：

原因：10代以内细胞一般能保持正常的二倍体核型

（2）受体细胞：减数第二次分裂中期去核卵母细胞

卵母细胞作为受体细胞的原因：

体积大，易操作

含有激发细胞核全能性的物质

去核的原因：使后代的性状主要由供体细胞核决定

去核的方法：显微操作

（3）激活细胞的方法：电脉冲，钙离子载体，乙醇，蛋白酶合成抑制剂

（4）获得克隆动物与供核动物性状不完全相同的原因：

可能发生基因突变

性状是由基因和环境共同作用的结果

克隆动物大部分DNA来自供体细胞的细胞核，但其核外线粒体中DNA来自受体细胞

动物细胞融合1.动物细胞融合：是两个或多个细胞结合形成一个细胞的过程，也称细胞杂交。

杂交细胞：融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性

2.动物细胞融合诱导方法

（1）物理法：离心，振动，电激

（2）化学法：聚乙二醇(PEG)

（3）生物法：灭活的病毒(动物细胞融合特有的方法)

3.注意

（1）细胞融合的过程包括细胞膜的融合、细胞质融合和细胞核融合。

（2）在细胞膜融合中体现出细胞膜具有流动性。

（3）其中细胞膜的融合是细胞融合的先导，没有细胞膜的融合就不会有细胞质和细胞得到融合。

(4)动物细胞融合的实质及结束的标志都是细胞核的融合。

4.优点与应用

(1)优点;突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。

应用

(1)细胞融合技术是研究细胞遗传，细胞免疫，肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。

利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。

单克隆抗体

1.传统抗体的获得：

(1)方法：

①向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体；

②从动物血清中分离所需抗体。

(2)缺陷：产量低、纯度低、特异性差。

2.比较制备单克隆抗体中的几种细胞：

B淋巴细胞：能产生单一抗体，但不能无限增殖

骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体

杂交瘤细胞：既能产生专一抗体，又能无限增殖

3.制备单克隆抗体需要的技术手段：动物细胞融合和动物细胞培养

原理：细胞膜的流动性和细胞增殖

4.单克隆抗体的制备

（1）免疫处理：提供B淋巴细胞的动物必须先经过免疫处理，否则不会产生特异性抗体。

（2）诱导融合的方法：

物理法：离心，振动，离心

化学法：聚乙二醇(PEG)

生物法：灭活的病毒(动物细胞融合特有的方法)

5.仅考虑两两融合的情况，形成的杂交细胞有三种

B淋巴细胞和B淋巴细胞融合的细胞

骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合的细胞

杂交瘤细胞

6.杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量增殖，又能产生某种特异性抗体

7.两次筛选的目的：第一次筛选的目的：筛选出杂交瘤细胞

第二次筛选的目的：筛选出产生特定抗体杂交瘤细胞

8.获取单克隆抗体的场所

(1)若在培养基中进行杂交瘤细胞培养，则培养液中提取

(2)若在小鼠和其他动物的腹腔中进行培养，则从腹水中提取。

腹腔培养：易于控制培养条件，成本低，但规模小，产量低

体外培养：规模大，产量高，但不易于控制培养条件，成本相对较高

9.杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体

单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏性高，可大量制备

10.单克隆抗体的应用：

(1)作为诊断试剂

(2)用于治疗疾病和运载药物