第一篇：基因工程

基因工程

添加时间：202_.10.29 | 作者：admin

基因工程实验注意事项

1． 上实验课的学生每三人分为一个小组。

2． 课前要预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。认真制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。

3． 实验指导中所写的实验

一、实验二等并非严格的实验顺序，只是提供一种相关的实验操作技术。各小组学生应根据整体的实验策略制定自己的实验顺序和计划。

4． 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。

5． 本实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在两周之内完成。

6． 实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！

7． 对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器和离心机！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。

8． 写作实验报告和实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻（包括操作的错误）。

9． 在实验室内不能大声喧哗。

10．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地投弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

11．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验室。12．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。13．实验时损坏的任何物品都要及时申报。

实验流程参考图

PCR扩增CHI

制备感受态菌XL1-Blue

提质粒pBS-CHI，Pinpoint™xa-3 11ppMD18-TppMD18-T

EcoRV+BamHI酶切

与pUCm-T连接

转化XL1-Blue

筛选鉴定

提重组质粒pUCm-T-CHI

回收Pinpoint™xa-3

EcoRV+BamHI酶切

回收CHI片段

重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI

IPTG诱导表达

SDS-PAGE检测

转化XL1-Blue

与Pinpoint™xa-3连接

Pinpoint™xa-3

pBS-CHI

XL1-Blue

XL1-Blue BL21（DE3）

筛选鉴定

提重组质粒Pinpoint™xa-3-CHI

转化XL1-Blue

重组质粒pUCm-T-CHI

第一部分质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定

实验一 质粒DNA的小量制备

1．目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2．原理

根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌器等。4．试剂

Pinpoint™xa-3质粒载体菌，pBS-CHI载体菌，LB培养基1000ml（含100µg/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。5．实验准备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20°C保存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 搅拌完全溶解，用约200ml 5N NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1L，121°C 20min灭菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸调pH4.8，补dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；摇菌试管洗净并盖上棉塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C 30min）。6．操作步骤

（1）在超净工作台中取5ml LB（Amp），加入灭菌的摇菌试管中。

（2）从超低温冰箱中取出保存Pinpoint™xa-3载体的菌种和pBS-CHI的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融化！），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100µg/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37°C摇床中摇12~16h。

Pinpoint™xa-3菌： 接种于5ml LB（Amp）； pBS-CHI菌：接种于2ml LB（Amp）。（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。

Pinpoint™xa-3菌：3管（3×1.5ml）； pBS-CHI菌：1管（1.5ml）。

（4）在沉淀中加入100µl 溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。）

（5）加入200µl 溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。（6）加入150µl 溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（7）15000rpm离心5min，小心吸取400µl 上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！），加入800µl 无水乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。（8）15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，加入500µl 75%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。

（9）再加入500µl 75% 乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净。

（10）离心管倒置于37°C培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！）。（11）pBS-CHI加入30µl 无菌蒸馏水或TE缓冲液； 3管质粒中每管加入10µl蒸馏水混匀后收集到一个管中，涡旋混合器上混匀，在离心机中瞬时转一下，使溶液集中在管底。待电泳确认（见实验二）后再在Pinpoint™xa-3质粒中加入1µl RNaes A。用记号笔标记后放入冰箱中备用。

r

r

r（12）清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告。7．思考

（1）影响本实验结果的因素有哪些？

实验二 质粒DNA电泳鉴定

1．目的

学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。4．试剂

Pinpoint™xa-3质粒，pBS-CHI载体，TAE电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液（或6´加样缓冲液），DNA分子量标准（DL2000）。5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（50´储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，ddH2O 定容至1L），10´加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6´加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6．操作步骤

（1）称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml 正好倒两块小胶。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50~60°C）。

（4）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10~20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。

（5）在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。

（6）待胶完全凝固后（15~20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（7）剪1片光面纸（或封口膜），点6µl蒸馏水、1µl 10´加样缓冲液，再加入3µl质粒DNA溶液制成10µl DNA样品。

（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10µl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3µl DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。

（9）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30分钟。

（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。（11）把凝胶放入凝胶成像系统中拍照。

（12）清理桌面垃圾，清洗实验仪器，撰写实验报告。7．思考

（1）泳道中的质粒DNA有几条带？为什么？（2）溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?（3）影响本实验结果的因素有哪些？

实验三 质粒DNA的酶切

1．目的

学会用限制性内切酶切割质粒DNA。2．原理

II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。4．试剂

Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（50´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。6．操作步骤

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中： Pinpoint™xa-3 DNA(或pUCm-T-CHI)6 μl 10×酶切缓冲液（用EcoRV的缓冲液）μl ddH2O 30 μl EcoRV 1μl BamHI 1μl 总体积 40μl

（2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1~3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

（6）酶切后的质粒可以回收备用（见实验六：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段）。（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。7．思考

（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

（2）如何估计DNA用量和酶的用量？

（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？

第二部分 目的基因的获得和重组载体的构建

实验四 PCR扩增制备目的基因

1．目的

学会PCR操作的基本技术。2．原理

是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）倍。其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。4．试剂

n 5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pBS-CHI，无菌ddH2O。5．实验准备

dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，荧光染料，10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇

Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇

目的基因模板质粒：已经克隆在pBS载体上的1128bp几丁质酶（chitinase，CHI）基因。

待扩增的CHI片段长度：996bp。6．操作步骤

（1）在0.2ml PCR 微量离心管中配制50μl反应体系。（以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算）

ddH2O 32μl

10×PCR buffer（不含MgCl2）

5μl

25mM MgCl2 3μl

2.5mmol/L dNTP 4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）

10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）

10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）

模板质粒 1μl（1×10pmoles）

5U/μl Taq酶 1μl（5U）

总体积

50μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

-3 ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。观察胶上是否有预计的主要产物带。（4）清理桌面，撰写实验报告。

（5）PCR产物可以直接与T载体连接（见实验五），然后转化感受态细胞（见实验八）。7．思考

（1）复性温度如何确定？

（2）为什么要在最后延伸10min？

（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？

实验五 目的基因片段与载体连接

1．目的

学会DNA片段的体外连接技术。2．原理

在Mg和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。2+4．试剂

pUCm-T 载体，Pinpoint™xa-3酶切载体，CHI插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddH2O。

5．实验准备

1.5ml离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基（含Amp）。6．操作步骤

1）PCR产物与pUCm-T载体直接连接：

（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16°C。（2）取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入： 4μl PCR 产物混合液 1μl pUCm-T载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系

（3）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C水中保温过夜。（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。

2）DNA回收片断（CHI）与载体（Pinpoint™xa-3）连接：（1）取一个灭菌的0.2ml微量离心管，加入 4μl 回收DNA片断 1μl 酶切后回收的载体

0.5μl T4 DNA连接酶（TAKARA, 350U/ul）1μl 连接酶缓冲液 3.5μl ddH2O 总量 10μl 体系

（2）上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于16°C干式恒温仪（或16°C水中）中保温过夜。（3）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4°C冰箱备用。7．思考

（1）连接酶的最适温度室多少？

（2）为什么要采用16°C下连接？

（3）如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？

实验六 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1．目的

学会从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的基本技术。2．原理

限制性内切酶切割后的DNA片断经过电泳后，按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA酶切片段。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉，水漂，恒温水浴。4．试剂

电泳缓冲液，荧光染料，电泳级琼脂糖粉，10´加样缓冲液，DNA分子量标准（DL2000），DNA凝胶回收试剂盒。5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（10´储存液），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）； 6．操作步骤（1）用1´TAE配制1%琼脂糖凝胶。DNA用合适的酶切。

（2）在胶上选定两个加样孔，分别加入少量（10μl）和大量（50μl）DNA酶切产物，电泳。

（3）电泳结束后用刀片切下含有少量DNA酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边缘），在紫外灯下找到目的DNA带，用刀片切在带的下上下边缘各切一个小口作为标记。注意：含有大量DNA酶切产物的凝胶既不用加荧光染料，也不用紫外灯照射！

（4）将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色的大胶上DNA酶切产物的位置，用刀片切下大胶中DNA产物所在的凝胶（尽量不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的1.5ml微量离心管中。再称量后计算出胶的重量。

（5）按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。纯化/回收试剂盒组成：

溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚红；

溶液B：3M NaAc；

溶液C：用时加入35ml无水乙醇；

溶液D：TE缓冲液。胶回收步骤如下：

① 将切下的胶带放入1.5ml离心管中，按照1：3(胶带重量：溶液A的体积)的比例加入溶液A；

② 50℃水溶10min，胶带完全要求完全溶化，其间可振荡助溶2～3次，待溶化后置室温加入15μl溶液B，充分混匀；

③ 将溶液置于离心柱中，静置2min，10000rpm离心20s；

④ 倒掉液体，加入500μl溶液C于离心柱中10000rpm离心20s，弃液体，重复该步骤一次；

⑤ 12000rpm离心1min，甩干剩余液体以除去残余乙醇；

⑥ 将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽； ⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，静置2min；

⑧ 12000rpm离心1min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20℃可长期保存。（6）清理桌面，撰写实验报告。7．思考

（1）为何避免用荧光染料染色和用紫外灯照射目的DNA？

第三部分 感受态细胞的制备和转化及筛选鉴定

实验七 感受态菌的制备

1．目的

学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。2．原理

细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4．试剂

E.coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O 5．实验准备

1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。6．操作步骤

（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。

（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（<0.4~0.6，细胞数<10/ml，此为关键参数！）。以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。7．思考

（1）制作感受态菌的过程中，应注意那些关键步骤？

（2）CaCl2溶液的作用是什么？

实验八 细菌转化

1．目的

学会质粒DNA转化感受态受体菌的技术。2．原理

质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA。然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。3．器材

8旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。4．试剂

LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。5．实验准备

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。6．操作步骤

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

（8）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

（9）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。

（10）观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。7．思考（1）影响转化效率的因素有哪些？

（3）白色菌落出现的原理是什么？

实验九 转化克隆的筛选和鉴定

1．目的

学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。2．原理

利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片段的克隆菌落。3．器材

旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。4．试剂

LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，70%甘油（70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0）。5．实验准备

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml氨苄青霉素。6．操作步骤

方法一：酶切鉴定

（1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3ml LB（含50mg/ml氨苄青霉素），用记号笔写好编号。（2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3ml LB（含50mg/ml Amp）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。

（3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。（4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片段大小是否与预期相符。

（5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500ml菌液与500ml 70%甘油混合后-80℃保存。（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。方法二：快速PCR筛选法

（1）在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

ddH2O 16μl

10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl

25mM MgCl2 1.5μl

2.5mmol/L dNTP 2μl（每种dNTP终浓度0.2mM）

10μmol/L Primer1 1μl（12.5~25pmoles）

10μmol/L primer2 1μl（12.5~25pmoles）

Taq酶 0.5μl（1.5U）

总体积 25μl

模板质粒： 用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min（2）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳（与原始插入片段同时比对）。观察胶上是否有预计的主要产物带。

（3）按照编号找到培养皿中的原菌斑，根据需要进行放大培养提取其质粒。

（4）提取到的质粒与原先的空载体（或已知分子量的质粒）再对比电泳，用酶切以进一步确认。

7．思考

（1）PCR法筛选的优点和缺点是什么？（2）酶切法与PCR法筛选方案哪个更可靠？

（3）最终确认克隆的方法有哪些？

第四部分 目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定

实验十 外源基因的诱导表达

1．目的

了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。2．原理

外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。3．器材

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4．试剂

LB培养基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。5．实验准备

无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml IPTG（过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），100mg/ml氨苄青霉素（过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中，终浓度为0.2%）。6．操作步骤

（1）晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有Pinpoint™xa-3-CHI重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的摇菌管中，慢速70~90转/分钟30°C摇菌过夜。

（2）至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170转/分钟37°C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。

（3）4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，用SDS-PAGE电泳分析（表达蛋白分子量为30kDa）。菌体也可放在-20°C以下保存备用。

（4）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。7．思考

（1）IPTG的作用原理是什么？

（2）为什么要增加抗菌素的用量？

实验十一 SDS-PAGE检测表达蛋白

1．目的

学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。2．原理

蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。4．试剂

SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。5．实验准备

1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；10%Aps（-20°C保存）；2´上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml，0.1%溴酚蓝 0.5ml，b-2-巯基乙醇 1.0ml，ddH2O 2.5ml，室温存放）；5´电泳缓冲液（Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加ddH2O至500ml，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O定容至100ml）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）； 6．操作步骤

（1）将表达后的菌体与2´上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。

（2）用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入溶液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！

（3）将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。

（4）按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。（5）配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH8.8）：

Acrylamide-bis 3.96 ml 1M Tris PH8.8 4.38 ml ddH2O 3.432 ml 10% SDS 118.8 μl

TEMED 9.9 μl 10%APS 118.8μl

（6）加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻缓缓倒入玻璃夹缝中，直到液面与所作的标记齐平。剩下的胶液留在小烧杯中，倾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器轻轻地沿玻璃壁来回移动加满ddH2O（尽可能不破坏下面的胶液）。然后静置30min。直到烧杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸馏水，并倒置玻璃尽可能将水倒尽。

（7）配支持胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为 pH6.8）：

Acrylamide-bis 0.675 ml 0.5M Tris pH6.8 0.563 ml ddH2O 3.165 ml 10% SDS 45 μl TEMED 7.5 μl 10% APS 45μl

（8）加完APS后拿起烧杯轻轻转动几下底部将溶液混匀后，立刻倒入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20min。烧杯中剩下的溶液倾斜放置直到溶液凝固。（此状态可以用塑料薄膜包起来放入冰箱过夜）。

（9）小心拔出梳子以后，用注射器针头（剪平尖部）吸取梳子齿形成的加样槽中的水，并修平加样槽底部的胶面。

（10）选取几个形态好的加样槽，在一张纸上做好对应的标记，用微量移液器在侧面的一个加样槽中加入20μl 蛋白分子量标准Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的样品。（11）加完样品后，再用微量移液器吸取电泳缓冲液小心把加样槽液面都补平。电泳槽上部倒满电泳缓冲液（约250ml,淹没过加样槽的液面！），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180ml）。

（12）接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约2~3h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。

（13）在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。

（14）倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃，小心用铲子从下部将带有缺口的玻璃板撬起（切不可损坏胶！）。用铲子切去上部的支持胶，并把分离胶从玻璃上剥离倒染液搪瓷盘里（切不可损坏胶！）。（15）染色2h后，将染液倒回瓶子里以备重复使用。把胶移入脱色液，过夜。

（16）观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（CHI蛋白约30kDa），判断是否是预期的基因产物。（17）清理桌面，写实验报告。7．思考

（1）影响表达的因素都有哪些？

（2）如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？（3）表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？

（4）本实验能否判断表达产物一定是CHI蛋白？还需要什么方法？（5）如何估计表达产物的分子量？

附录1：表达载体Pinponit™xa-3的图谱：

附录2：所用的chitinase（玉米几丁质酶）序列（GenBank：L00973）：

>L00973

gcaacaccag cttctctaaa gatcacaatg atgagagccc tggcgtggtg gccatgctgg cccgccttct tcgctgtgcc cgctcgcgcc gagcagtgcg ggtcgcaggc cggcggcgcg ctgtgcccca actgcctgtg ctgcagccag ttcgggtggt gcggcagctc cgactactgc ggcagcgggt gccagagcca gtgcagcgca gcctgcagca ccccgaaccc gccgagcagc ggcggcgtgg cgtccatcat ccccgagtcg ctcttcaacc agatgctgct gcaccgcaac gacgcggcgt gccccgccaa cggcttctac acctacgcgg gcttcatcgc ggcggccaac gcgttcccgg gcttggcacc acgggtgcgg cccgacgtgc agaagcgcga gctggcggcg ttcctggcgc agacgtccca cgagacgacg ggcgggtggg cgacggcgcg acggccctac gcctggggct actgcttcaa ggaggagcag ggcggcgcgt cggggccgga ctactgcgag cccagcgccc agtggccgtg cgccgcgggg aagaagtact acgggccgcg ggccatccag atctccatca acatcaacat cgggcccgct ggcaggccat cggcgcccgg catcctcgcc aacccggacc tggtggccac ccgaccccac cgtgtcgttc gaagaccgcc gtctggttct gggatgaccc cgcagtcgcc caagccgtcg tgcaccgacg tcatgacggg gcagtggacg ccctccgccg ctgacacggc cgccggcagg ctgccgggct acggcgtcgt caccaacatc tccaacggcg gcctcgagtg cggccatggc gctgacagcc gcgtcgccga ccggatcggc ttctacaaac gatactgtga cttgcttggg gtcagctacg gcgacaactt ggactgcgcc aaccagacgc ctttcaacgg ctagttaata agctagctac ctcaccatgc atgtctgcct tattattaga gacacaataa gacctgatcg atatgatgat gggtatgcat gtattacttt actacacgca gatccagcaa tcaagaataa agcaaattaa tgtttact

附：

DL2000分子量标准（bp）低分子量蛋白质Marker（kDa）

附录3：本实验所用的pUCm-T克隆载体图谱

选做实验

实验一 拟南芥基因组DNA的分离提取

【实验目的】

F 掌握拟南芥基因组DNA的抽提原理和方法。【实验原理】

通常采用机械研磨的方法破碎拟南芥的组织和细胞，由于拟南芥细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异戊醇使DNA沉淀，即得拟南芥总DNA。【实验器材】

F 试剂耗材：提取液（0.2M Tris-HCl(pH7.5)、0.5%SDS、0.25M NaCl、1%β-巯基乙醇）、异丙醇、氯仿、异戊醇、RNAase A、研钵、液氮、1.5ml离心管。F 仪器：恒温水浴锅、离心机。【方法步骤】

（1）取新鲜的拟南芥叶片2~3片加入1.5ml的离心管中，加入液氮，玻璃棒研碎。（2）研磨以后，加入600~700µl的提取液，混匀，然后在60℃下水浴20~60分钟。（3）4℃，12000rpm/min离心10分钟。

（4）把上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），4℃，12000rpm/min离心7分钟。

（5）把上清转至新的离心管中，加入70%体积的异丙醇，混匀，4℃，12000rpm/min离心15分钟。（6）弃上清，70%乙醇洗涤沉淀2次，吹干。

（7）沉淀用20~30µl含有0.1mg/ml RNAase A的ddH2O溶解。（8）用0.8%的琼脂糖凝胶检测提取的拟南芥总DNA。【实验结果】

1.拟南芥总DNA的电泳结果。【实验思考】

1.依据你的理解，拟南芥总DNA的提取过程中应注意那些操作？ 【参考文献】

邹华文，黄丛林.一种简单快速的拟南芥基因组DNA的微量提取方法.长江大学学报B（自然科学版），202_，4.实验二 果蝇白眼突变基因的克隆

【实验目的】

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解质粒提取的原理和方法。【实验原理】

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。【实验器材】

F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

2+F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。【方法步骤】

（一）引物设计

从NCBI上下载果蝇的白眼突变基因序列（GenBank登录号：X51749），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。

（二）目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：

模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：

94℃预变性4min；

94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；

72℃总延伸10min，4℃保存。

取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。

（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收

将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

（四）目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

（五）连接产物的转化

(1)取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

(4)加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

(5)制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。

（六）重组质粒的筛选

分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

(1)取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；(2)加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

(4)加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；(5)4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

(6)以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；(7)4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；(8)加入400μl三氯甲烷摇匀，4℃，12000rpm离心5min；(9)取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；(10)弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；

(11)加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。(七)重组质粒的测序验证

将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。【实验结果】

2.目的基因的PCR电泳结果。3.质粒电泳结果。4.测序验证结果。【实验思考】

1.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。

2.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。3.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。

4.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。【参考文献】

1.J.萨姆布鲁克，D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，202_.2.Pepling M, Mount S M.Sequence of a cDNA from the Drosophila melanogaster white gene.Nucleic Acids Res.1990,18(6):1633.实验三 家蚕油蚕突变基因的克隆

【实验目的】

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解质粒提取的原理和方法。【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。【实验器材】

F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。【方法步骤】

（三）引物设计

从NCBI上下载家蚕油蚕突变基因序列（GenBank登录号：AB060285），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。

（四）目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：

模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：

2+ 94℃预变性4min；

94℃变性40s，48℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；

72℃总延伸10min，4℃保存。

取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。

（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收

将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

（四）目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

（五）连接产物的转化

(1)取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

(4)加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

(5)制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。

（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

(1)取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；(2)加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

(4)加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；(5)4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

(6)以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；(7)4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；(8)加入400μl三氯甲烷摇匀，4℃，12000rpm离心5min；(9)取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；(10)弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；

(11)加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。(七)重组质粒的测序验证

将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。【实验结果】

5.目的基因的PCR电泳结果。6.质粒电泳结果。7.测序验证结果。【实验思考】

5.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。

6.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。7.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。8.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。【参考文献】

1.J.萨姆布鲁克，D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，202_.2.Kômoto N.deleted portion of one of the two xanthine dehydrogenase genes causes translucent larval skin in the oq mutant of the silkworm(Bombyx mori).Insect Biochem Mol Biol.202_ ,32(6):591-597.实验四 拟南芥叶片花斑突变基因的克隆

【实验目的】

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解质粒提取的原理和方法。【实验原理】

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。【实验器材】

F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。【方法步骤】

2+

（五）引物设计

从NCBI上下载拟南芥叶片花斑突变基因序列（GenBank登录号：NM_123592），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。

（六）目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：

模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：

94℃预变性4min；

94℃变性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；

72℃总延伸10min，4℃保存。

取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。

（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收

将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

（四）目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

（五）连接产物的转化

(1)取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

(4)加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

(5)制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。

（六）重组质粒的筛选

分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

(1)取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；(2)加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

(4)加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；(5)4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

(6)以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；(7)4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；(8)加入400μl三氯甲烷摇匀，4℃，12000rpm离心5min；(9)取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；(10)弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；(11)加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。(七)重组质粒的测序验证

将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。【实验结果】

8.目的基因的PCR电泳结果。9.质粒电泳结果。10.测序验证结果。【实验思考】

9.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。

10.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。11.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。

12.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。【参考文献】

1.J.萨姆布鲁克，D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，202_.2.Sakamoto W, Tamura T, Hanba-Tomita Y, et al.The VAR1 locus of Arabidopsis encodes a chloroplastic FtsH and is responsible for leaf variegation in the mutant alleles.Genes Cells.202_,7(8):769-780.实验五 线虫unc-22突变基因的克隆

【实验目的】

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解质粒提取的原理和方法。【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。【实验器材】

F 试剂耗材：Taq DNA聚合酶、安苄青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T载体、LB培养基、培养皿、涂玻棒、移液枪、枪头、1.5ml离心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、无水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 仪器：PCR仪、恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴锅、离心机、无菌操作台。【方法步骤】

（七）引物设计

从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。

（八）目的基因片段的PCR扩增 25µl反应体系：

模板cDNA 1.5µl 10×reaction buffer 2.5µl 2.5mM MgCl2 2µl 2.5mM dNTP 2µl 上游引物 1µl 下游引物 1µl Taq DNA聚合酶 0.2µl 加ddH2O至总体积 25µl 按照以下程序进行PCR扩增：

2+ 94℃预变性4min；

94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；

72℃总延伸10min，4℃保存。

取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液、100V恒压)，用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA片段的大小和纯度。

（三）目的基因片段PCR产物的纯化回收

将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照北京鼎国生物技术有限公司生产的DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。

（四）目的基因片段与克隆载体的连接

PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下： 纯化回收的PCR产物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。

（五）连接产物的转化

(1)取出-80℃保存的制备好的感受态细胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl连接产物，轻轻混匀后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中热击90s，轻轻放回冰上冷却2min；

(4)加入880µl LB液体培养基(不含氨苄青霉素)和20µl葡萄糖，37℃摇荡培养1h；

(5)制备X-gal平板：取40μl X-gal、4µl IPTG和56µl灭菌双蒸水混匀后均匀地涂布于含100µg/μl氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取适量的菌液(200µl)，涂布于X-gal平板上，37℃培养1h后，倒置培养14～16h。

（六）重组质粒的筛选 分别挑取白色和蓝色单菌落于5ml LB液体培养基中(含100µg/µl氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养，用碱裂解法抽提质粒DNA。步骤如下：

(1)取适量菌液于1.5 ml的离心管中，瞬时离心，倒掉培养基，尽可能倒干净；(2)加溶液I 100μl，涡旋重新悬浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，轻轻摇匀，在冰上放置3～5min使大肠杆菌裂解，释放质粒DNA；

(4)加预冷的溶液III 150μl，轻轻颠倒摇匀，出现白色絮状沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反应；(5)4℃，12000rpm离心8min，转移上清至1.5ml离心管；

(6)以体积比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，轻轻摇匀，静置2分钟；(7)4℃，12000rpm离心10min，转移上清至1.5ml离心管；(8)加入400μl三氯甲烷摇匀，4℃，12000rpm离心5min；(9)取上清加2倍体积预冷的无水乙醇，4℃，12000rpm离心8min；(10)弃上清液,加75%乙醇1000μl洗涤2次，放置干燥；

(11)加50μl 双蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保温2h，电泳检测(电泳中以蓝斑质粒DNA为对照，出现滞后带的确认为重组质粒)后-20℃保存备用。(七)重组质粒的测序验证

将提取纯化后的质粒送至上海生物工程公司进行测序得到克隆基因的碱基序列，分析验证克隆的目的基因的正确性。【实验结果】

11.目的基因的PCR电泳结果。12.质粒电泳结果。13.测序验证结果。【实验思考】

13.目的基因片段与克隆载体连接过程中的注意事项。

14.影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。15.简述热激法转化和蓝白筛选的原理。16.简述碱裂解法提取质粒的原理以及各试剂的作用。【参考文献】

1.J.萨姆布鲁克，D.W 拉塞尔.《分子克隆实验指南》（第三版），科学出版社，202_.2.Wang,W.and Shakes,D.C.Isolation and sequence analysis of a Caenorhabditis elegans cDNA which encodes a 14-3-3 homologue.Gene.1994, 147(2), 215-218.

第二篇：基因工程

《基因工程论文》

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

学

院：生命科学学院 班

级：生物技术12-2 学

号：7011208209 姓

名：陈 昆 任课教师：张锐

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料

实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法

DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷

烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析

2.1 MD-2基因组DNA的检测

对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选

通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长

基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用

由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含

量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。

实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论

以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,202_,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,202_,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,202_,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,202_,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地

质与采收率,202_,15(1):77-79.[6] 宋智勇,张君,马继业,等.微生物菌液的界面特性[J].油气地质与采收率,202_,15(3):73-75.[7] 蒋焱,曹功泽,赵凤敏,等.聚合物驱后微生物提高采收率的可行性分析[J].油气地质与采收率,202_,15(5):63-65,68.[8] 陈爱华,方新湘,吕秀荣,等.克拉玛依油田内源微生物驱油机理探索[J].油气地质与采收率,202_,15(5):75-77.[9] 宋绍富,刘菊荣,张忠智.微生物采油替代营养源的研究[J].油气地质与采收率,202_,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驱替盲端类剩余油的微观实验[J].油气地质与采收率,202_,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,202_:143.[12]唐赟,冯露,刘沐之,等.嗜热解烃菌NG80-2的鉴定及其特[J].南开大学学报,202_,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,译.北京:科学出版社,1992.[14]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第三篇：基因工程

宁波大学科学技术学院考核答题纸

（202_--202_学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

基因工程

摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。

关键词：生物技术；基因工程

一、基因工程的诞生：

从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。

理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。

技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。在1970年Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。后来发现的大量的限制性核酸内切酶。第二，一些病毒、质粒和噬菌体等载体技术的发现使把目的基因的导入更加容易。第三，DNA分子序列分析及琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交技术的发展使得基因工程的诞生越来越近。1973年，斯坦福大学将抗四环素质粒和抗新霉素的质粒用限制性内切酶切割并连接成重组质粒导入到大肠杆菌中是基因工程诞生的标志。

二、基因工程有几个重要特征：（1）、打破了物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）、通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良；（3）、创造出自然界中本来不存在的物种。

三、基因工程技术流程包括：（1）、目的基因克隆，即从特定生物基因组和cDNA中分离提纯和扩大繁殖目的基因；（2）、选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆；（3）、将目的基因与载体宁波大学科学技术学院考核答题纸

（202_--202_学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

连接；（4）、将重组DNA导入到大肠杆菌或酵母菌体内培养；（5）、利用载体上的标记基因进行筛选，获得转目的基因的细胞或植株。

四、基因工程的应用：

（1）基因工程应用于农业生产方面：农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。

（2）基因工程应用于医药方面：目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。

（3）基因工程应用于环保方面：基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性问题：

自基因工程诞生以来，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注，关于重组DNA潜在的危险性问题的争论，在基因工程还处于酝酿阶段的时候就已经开始。争论的焦点是担心基因工程宁波大学科学技术学院考核答题纸

（202_--202_学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：的杂种生物会从实验室溢出，在自然界造成难以抑制的灾难，有害的杂种菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美国国立卫生研究院（NIH）在加利福尼亚州的Asilomar 会议中心内，160名来自美国和16个国家的专家学者对重组DNA的危害辩论，虽然与会代表分歧挺大，但最后也达成了一些重要的共识，在1976年6月23日美国NIH制定并公布了《重组DNA研究准则》。为了避免可能造成的危害，除了规定禁止若干类型的重组DNA实验外，还制定了许多具体的规定条文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技术是继工业革命、信息革命之后 对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗、基因芯片和基因克隆等技术方面取得的革命性成果，将极大地改变人类生命和生活面貌。

参考文献：

1、基因工程/楼士林，杨盛昌，龙敏南等主编.—北京：科学出版社，202_

2、基因工程技术/钟卫鸿主编.—北京：化学工业出版社，202_.6

3、基因工程/何水林主编.—北京：科学出版社，202_

4、基因工程原理与技术/刘志国主编.—2版.—北京：化学工业出版社，202_,12

5、基因工程：原理、方法与应用/徐煜泉等编著.—北京：北京大学出版社，202_.12

第四篇：材料基因工程

材料基因工程

——为什么是一项“颠覆性前沿技术”

1.前言

材料基因组技术是近几年兴起来的材料研究新理念和新方法，是当今世界材料科学与工程领域的最前沿。材料基因工程借鉴人类基因组计划，探究材料结构与材料性质变化的关系。并通过调整材料的原子或配方、改变材料的堆积方式或搭配，结合不同的工艺制备，得到具有特定性能的新材料。但是材料基因组与人类基因组的又有很大的区别，材料的微观结构多样化，不但成分组成可以不同，微观形貌等结构也可能千差万别，其组成-结构-性能之间的关系更加复杂。

2.材料基因组技术

2.1材料基因组技术

材料基因组计划是通过“多学科融合”实现“高通量材料设计与试验”；其核心目标在于通过“高通量计算、实验和大数据分析”技术加速材料“发现-研发-生产-应用”全过程，缩短材料研发周期，降低材料研发成本，引发新材料领域的科技创新和商业模式变革。

材料基因组技术包括高通量材料计算方法、高通量材料实验方法和材料数据库三大组成要素。

2.1.1高通量材料计算方法

高通量计算是指利用超级计算平台与多尺度集成化、高通量并发式材料计算方法和软件结合，实现大体系材料模拟、快速计算、材料性质的精确预测和新材料的设计，提高新材料筛选效率和设计水平，为新材料的研发提供理论依据。其中并发式材料计算方法包括第一原理计算方法、计算热力学方法、动力学过程算法等，跨越原子模型、简约模型和工程模型等多个层次，并整合了从原子尺度至宏观尺度等多尺度的关联算法。

高通量材料集成计算技术利用第一性原理、分子动力学与位错动力学、合金相图计算、相场计算等方法，快速并行模拟实验室中成分与性能优化的传统试错式材料研发过程，并基于材料科学知识，迅速挑选有利于目标性能的合金成分与微观结构特征，从而加速新材料的研发进程并显著降低材料研发成本。

2.1.2高通量材料实验方法

传统材料研发模式依赖于成分与工艺的不断“试错”实验优化，结合对结构-性能关系的不断理解以获得满足性能指标的材料。但是，新型关键材料具有成分多元化、复杂化、微结构多级化等特点，传统的“试错”模式在实际材料开发中不仅耗费巨大，而且几乎难以取得成功。

高通量实验平台是发展材料基因组技术具备的条件之一。高通量实验平台可以为据库提供数据支撑；而就高通量集成计算而言，高通量实验技术为各种计算模拟工作提供计算目标。材料基因组概念中的高通量实验技术具有快速制备快速表征各类金属与非金属样品的能力，典型的高通量实验方法有扩散多元结与材料基因芯片

2.1.3材料数据库

数据可以看作是感兴趣参量的具体数值，这些参量在空间与时间上的一系列数值就构成数据集，不同的数据集结合到一起并按照一定的协议实现相互调用，体量巨大、结构性的数据集就构成大数据。利用物理层面的分布式服务器对随时间不断膨胀的数据集进行存放，利用通讯协议实现服务器中数据集的远程调用与管理，利用专门的算法对不同数据集自身和数据集之间进行分析并提取有价值的信息，并用专门的软件实现数据分析的可视化，就构成了基于大数据方法的材料数据库技术。

材料信息学通过数据管理、数据分析与数据协作，实现从已有数据中提取高价值信息和知识的目的。由于计算材料数据库是综合物理，化学及生物的交叉学科的数据库。因此，材料数据库的建立，有利于减少材料的重复实验和测试，对缩短新材料的研发周期，节约新材料的研发成本具有非常积极的作用

2.2结论

材料计算模拟是实现“材料按需设计”的基础，可以帮助缩小高通量材料实验范围，提供实验理论依据；高通量材料实验起着承上启下的角色，既可以为材料模拟计算提供海量的基础数据和实验验证，也可以充实材料数据库，并为材料信息学提供分析素材，同时还可以针对具体应用需求，直接快速筛选目标材料；材料数据库可以为材料计算模拟提供计算基础数据，为高通量材料实验提供实验设计的依据，同时计算和实验所得的材料数据亦可以丰富材料数据库的建设。

3．结论

材料基因组技术融合了材料科学、固体力学、信息科学、软件工程、先进实验方法等学科，采用数值模拟、数据库及数据挖掘、人工智能等技术研究材料的工艺过程、微/细观结构、性能和服役行为等，阐明成分、微结构和工艺对性能的控制机制，引导并支撑实体材料的研发和应用。

在材料基因工程提出之前，新材料从研发到市场应用实践跨度非常大，某种材料从最初的研究开发，经过性能优化、系统设计与集成、验证、制造再到投入市场通常需要10-20年时间。部分原因是一直以来过度依赖对材料研发的科学自觉与实验判断，目前大部分材料的设计与测试时通过耗时的重复实验完成的、而实际上，有些实验通过理论计算工具就能完成模拟。材料基因工程采用强大的计算分析和理论模拟工具，减少新材料研发和生产过程中对物理实验的依赖。改进的数据共享系统和一体化的工程团队将允许设计、系统工程与生产活动的重叠与互动。这种新的综合设计将结合更多的计算与信息技术，加上实验与表征方面的进步，将显著加快材料投入市场的种类及速度，材料的开发周期可从目前的 10~20 年缩短为 5~10 年。因此说材料基因组技术是一项“颠覆性前沿技术”

参考文献

[1]李楠楠，沈一笋，臧亮，等.对比人类基因 探秘材料基因：人类基因组计划对材料基因组计划的启发.中国材料进展

[2]关永军，陈柳，王金三.材料基因组技术内涵与发展趋势.航空材料学报，202_（3）[3]刘利民.材料基因工程:材料设计与模拟[J].新型工业化，202_,5（12）；71-88 [4]向勇，闫宗楷，朱炎鳞，张晓琨.材料基因组技术前沿进展.电子科技大学学报，202_,6 [5]汪洪,向勇,项晓东,等.材料基因组技术—材料研发新模式[J].科技导报,202_,33(10): 13-19 [6]王海舟,汪洪,丁洪,等.高通量材料实验与表征[J].科技导报,202_,33(10): 31-49.[7]HOLDREN J P.Materials genome initiative for globalcompetitiveness[R].Washington D C, USA: NSTC, 202_.

第五篇：基因工程

基因工程技术的程序与应用

【摘要】基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，它将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解基因工程的概念、原理、技术程序，以及基因工程在农业、工业、医药等方面的应用和进展情况。

【关键词】基因工程技术程序应用进展

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在分子水平上对基因进行复杂的操作，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技术程序

基因工程的基本原理是在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成镶嵌DNA分子，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产物。它有3个基本的步骤：①从合适材料分离或制备目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段与载体连接作成重组DNA分子。③重组DNA分子引入宿主细胞，在其中扩增和表达。不同种类生物的生物学特性不同，其基因工程在操作上和具体技术上必然有所差异，但技术核心都是DNA的重组，即利用一系列的DNA限制性内切酶、连接酶等分子手术工具，在某种生物DNA链上切下某个目标基因或特殊的DNA片段，然后根据设计要求，将其接合到受体生物DNA链上。

一个完整的用于生产生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：①外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。②适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。③外源基因的导入。④外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。⑤外源基因表达产物的生理功能的检定。⑥转基因新品系的选育和建立以及转基因新品系的效益分析。⑦生态与进化安全保障机制的建立。⑧消费安全评价。

（一）外源目标基因的分离、克隆及功能结构分析

获合乎人类某种需要的取目的基因是实施基因工程的第一步，也是开展一项基因工程的前提和全部工作的核心。目前人们已经能够通过多种途径和方法来获取目标基因，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），1

从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

（二）构建能在受体生物细胞中表达的重组目标基因

要使一个外源目标基因能整合到受体细胞的基因组中并能在整合后在受体基因组的调控下有效地转录和翻译，就必须事先对目标基因的功能结构用DNA重组技术进行适当的修饰，也就是将目标基因与一种特别的DNA分子重组，这种特别的DNA分子称为基因载体，目前所用的载体主要有以下几类：质粒、λ噬菌体、柯斯质粒、病毒载体、YAC载体等，各类载体具有独特的生物学特性，可用于不同的目标基因。

（三）外源重组目标基因的导入

将重组的外源目标基因转入到宿主细胞中的过程称为基因导入或基因转移。接受外源基因的细胞称为受体细胞。由于受体生物学特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因导入的方法也不同，有的是用载体导入，有的是直接用物理的方法导入。目前使用的有转化、转染、电穿孔导入法、基因枪射入法、显微注射法、脂质体介导法等，向细菌等微生物中导入外源目标基因常用质粒转化和噬菌体转染方法；向植物细胞中导入外源基因常用基因枪注入法和Ti质粒导入法；能由原生质体再生出植株的植物细胞还可以用电穿孔导入法及脂质体融合法；动物的受精卵一般通过人工显微镜注射法导入外源基因；动物的体细胞可用电穿孔法和病毒转染法导入外源基因，但对用于生产目的的基因工程常常避免用病毒转染法。

（四）转基因细胞或个体的鉴别和筛选

在对宿主的细胞进行了外源目标基因导入处理以后，有些细胞可能并没有外源基因的进入，另有一些细胞可能在外源基因进入后因各种原因而不能使外源基因表达，因此必须对被进行了基因转移处理的细胞或个体进行鉴别，以筛选出导入外源目标基因的转基因细胞或个体。鉴别和筛选转基因生物一般在两个层面上进行：一是检测目标基因是否表达，二是检测目标基因是否整合到了宿主的染色体上和能否稳定传代。表达检测的方法主要有转录产物的印迹杂交法、免疫印迹检测法、免疫组织化学检测法等。整合检测可通过DNA分子杂交来确定。

（五）转基因品系的效益分析。

一个生产性能优越的转基因品系，首要的条件是目标基因的表达产物必须有正常的生理功能，另一个必要标志是其目标基因必须有适度的高效表达特性和可持续生产能力。

（六）生态与进化安全保障

由于转基因生物与其他生物一样具有可遗传、易扩散及自主的特性，而且人类对生命、生态系统、生物的演化实际上还知之甚少，对不同物种间基因的人工组合，外源基因对受体生物进化的可能影响，转基因生物对生态系统的长期影响

等都无法进行评估，因此如果人们不事先采取控制措施，转基因生物一旦进入到自然环境中就可能打破生态平衡，破坏生态环境和自然种质资源。对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去；生物的方法一般就是造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离，如利用三倍体不育的特性将用于生产的转基因动物或植物变成三倍体等。

（七）消费安全评价

消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：①导入外源目标基因本身编码的产物是否安全。②外源目标基因是否稳定。③使用的载体是否安全。④使用的报道基因（就是能产生很容易观察的性状的基因）是否会产生有害物质。⑤外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。为了保护人类的健康，许多国家都已通过立法或其他形式对转基因产品进行消费安全评价和严格的管理，对进口转基因食品严格限制。

二 基因工程的应用

基因工程在医药业中的应用。许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。如基因工程胰岛素、干扰素、人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。

基因诊断与基因治疗。遗传病是长期困扰人类的一类不治之症，迄今已发现的有3000多种。其根源于遗传基因存在缺陷，主要特征是可随生育而传代。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。基本方法是：基因置换、基因修复、基因增补和基因失活等。如运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。

基因工程在农牧业、食品工业上的应用。运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。如转基因鱼（生长快、耐不良环境、肉质好），转基因牛（乳汁中含有人生长激素），转黄瓜抗青枯病基因的甜椒，转鱼抗寒基因的番茄，转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯，不会引起过敏的转基因大豆，抗虫棉等。

基因工程在环境保护工业方面的应用。基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。如有一种超级细菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。这种超级菌是美国科学家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一个菌株内而产生的。

总之，基因工程的发展将会给人类社会带来巨大的变化。

三 基因工程的进展状况

基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。

1．基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。目前的基因工程在技术上有很多的不确定性。这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。我们对活的生物体中基因表达调控的机制知之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。

2．在安全性方面存在着不确定性。对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。

所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。

参考文献：

[1]罗琛主编，生物工程与生命，北京，高等教育出版社，202_；

[2]颜青山主编，洞悉生命的真谛，西安，陕西科学技术出版社，202_，11；

[3]刘祖洞编著，遗传学，北京，高等教育出版社，1991；

[4]王镜岩等主编，生物化学，北京，高等教育出版社；

[5]程玉忠;植物基因工程进展[J];遗传;1991年04期；

[6]刘金元;植物基因转移及其应用前景[J];生物技术;1994年06期；

[7]吴乃虎,黄美娟;植物基因工程的克隆载体[J];中国生物工程杂志;1987年02期；

[8]孟建华;农业基因工程研究进展报道[J];中国生物工程杂志;1989年01期；

[9]侯云德.动物病毒载体与基因治疗的现状和前景(续)[J].中国生物工程杂志, 1994,14(3)；

[10]李璇.植物抗性基因工程研究进展[J].中国生物工程杂志, 1991,11(2)；

[11]李以莞.基因工程抗体研究进展[J].中国生物工程杂志, 1991,11(4)；

[12]陈红梅,李昆志,陈丽梅.植物来源抗虫基因的研究进展[J].中国生物工程

杂志, 202_；

[13]陈章良, 潘乃穟.植物基因工程的现状、前景及问题[J].中国生物工程杂志, 1989,9(3)；

[14]TheodoreFriedmann, 杨靖.人类基因疗法的进展[J].中国生物工程杂志, 1990,10(3)；

[15]金由辛.真核生物tRNA基因的表达[J].中国生物工程杂志, 1994,14(1)；

[16]何晨阳, 王金生.植物防卫反应基因的类型、表达、调控和应用[J].中国生物工程杂志, 1994,14(4)；

[17]吴明.转基因作物研究、开发和市场预测[J].中国生物工程杂志, 1991,11(1)；

[18]戴秀玉.生物技术的由来[J].中国生物工程杂志, 1991,11(1)；

[19]门大鹏.质粒[J].中国生物工程杂志, 1993,13(3)；

[20]赵贵英;张树庸;;生命科学与生物技术研究进展202_[J];中国医药生物技术;202_年01期；

[21]北京大学 王岳;转基因:立法规范与人文反思[N];社会科学报；

[22]毛黎;科技创造未来美食[N];中国食品报；