下载文档第一篇：香菇的组织分离及培养
香菇的组织分离和培养
一、实验目的
1、了解食用菌的基础知识。
2、了解、掌握食用菌培养基的配置原理。
3、通过平菇栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法。
二、实验原理
（食用菌的组织分离法）
食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
三、实验材料
1、原种制作实验材料（1）食用菌：香菇。
（2）培养基：PDA培养基斜面。
（3）仪器或其他用具： 75%酒精棉球、接种针记号笔等。
2、食用菌的组织
离
2、食用菌的组织分离
（1）试剂： 棉籽壳、麸皮、蔗糖、CaCO3（2）仪器或其他用具：平菇菌种、香菇菌种、金针菇菌种、姬菇菌种、茶树菌种、台秤、盆子、聚丙烯塑料袋、颈圈、封口膜、橡皮筋、高压蒸气灭菌锅、pH试纸（pH 5.5—9.0）、记号笔、麻绳等
四、实验步骤
1、原种制作实验材料
（1）拌料 按培养料配方准确称取所需棉籽壳和麸皮放入大盆中用手搅拌混合均匀，将所需的蔗糖和CaCO3溶于水中，然后泼洒在棉籽壳和麸皮上，边加水边搅拌，直至均匀。搅拌好后，焖30分钟，使培养料吸水均匀。
（2）侧培养水分 培养料搅拌好后，用于抓一把培养料握在手中，攥紧，手指缝中有水印但无水滴滴下，这时的含水量适合，为60%—62%，若含水量不足，可再加少量的水，充分搅拌均匀，在检测，直至含水量合适为止。
（3）装袋 边加边将培养料压实，装至3/4左右，袋口套上颈圈，用木棒在培养料中打一洞，盖上封口膜，用橡皮筋扎紧。（4）灭菌 126 ℃高压蒸气灭菌90分钟。
（5）接种 栽培袋冷却到25℃左右，在超净工作台上用镊子或接种枪夹取所需菌种（1个鸡蛋大小）放入培养料袋的洞中。
（6）培养 接种后的栽培袋，放入23-25℃培养室，堆放高度三至四层，空气湿度60%-65%，每周翻堆一次，使上下发菌一致，同时挑出污染的栽培袋丢弃，一般30-40天，菌丝即可长满菌袋。
（7）出菇管理（8）采收
2、食用菌的组织分离
1、整菇插种法
（1）选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；
（2）种菇消毒：取1张菇片，用 70%的酒精轻擦表面进行消毒；
（3）菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；
（4）培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；
2、贴附法（1）、将接种针在酒精灯上灼烧，然后将接种针迅速插入斜面培养基的中间位置，使产生的水蒸气冷凝到试管壁上，再用接种针勾取香菇小片刚破膜的成熟菌褶，贴附于斜面相对应的试管相对应的试管内壁上，并使试管斜面朝上，平放在培养箱内，12—24h后，在试管斜面上就落下许多孢子。
2、贴附法（1）、将接种针在酒精灯上灼烧，然后将接种针迅速插入斜面培养基的中间位置，使产生的水蒸气冷凝到试管壁上，再用接种针勾取香菇小片刚破膜的成熟菌褶，贴附于斜面相对应的试管相对应的试管内壁上，并使试管斜面朝上，平放在培养箱内，12—24h后，在试管斜面上就落下许多孢子。
（2）在无菌条件下，用接种针将贴附在试管壁上的菌褶取出。
（3）将试管放入25℃温箱中培养1—2周，观察菌丝生长情况，选菌丝纯洁、粗壮、生长旺盛的试管进行保存并作出菇实验。
3、悬钩法（1）、在350ml容积的三角瓶内，装入50ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基，瓶口处垂挂一根“S”形的铁丝钩，塞上棉塞进行高压蒸汽灭菌，冷却后在将三角瓶放入30℃培养箱中培养2—3天，使培养基表面的冷凝水蒸发，备用。
（2）将银耳或木耳的新鲜子实体在无菌水中洗涤3次。
（3）在无菌室内用灭菌滤纸将耳片上的水吸干，如耳片过大，可用灭菌刀片切去一部分，然后将耳片悬钩在“S”形钩子上，子实体面朝下放入三角瓶内，将耳片离培养基2—3cm，勿使耳片碰到三角瓶壁，并将三角瓶移到有散射光的地方，在18—25℃下放置12—20h，即将有很多孢子散落在培养基表面上。
（4）取出耳片，将三角瓶至于28—30℃的恒温箱，待孢子萌发后，将萌发的孢子带着培养基块移入新的试管斜面培养基内，继续进行培养，待长出纯净、洁白的菌丝后即视为分离成功。
五、注意事项
1、在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。
2、要等刀片冷却后再切取组织块。
3、栽培种在培养过程中，应经常检查，污染袋要及时检查出处理掉。经过30—40天的培养，菌丝长满袋后即可使用。若菌袋内长出原基，说明菌种已经老化。若有黄、绿、黑等杂色斑点或连成片时，说明菌种已经污染，不可使用。
4、菌种的选择：优质菌种是决定栽培产量的主要因素。菌种选择不当会严重影响产量。一般选择外观为白色的菌种。如有其它真菌污染, 从菌种外观上可看到其它颜色的菌落。正常的原种和栽培种在生长中和长满时都应色泽鲜亮、上下一致、洁白、而不应灰暗苍白。如果一瓶(袋)菌种, 上下色泽不一致, 特别是上部灰暗时, 应剔除不用。
5、优质的栽培材料和良好的栽培环境：原料是提供食用菌发菌和出菇的物质条件。不管利用什么原料, 都必须严格掌握质量, 其中生料和发酵料尤为重要。基本要求是: 原料新鲜、干净、无霉变, 没有因潮湿而产生的结块。播种前和栽培管理中后期, 必须对栽培场所进行认真的清洁和消毒。、
第二篇：藻类的分离和培养
藻类的分离和培养
微型藻类的分离和培养方法基本上与菌类的方法相似，但还需加上光照条件，并以液体培养为主。在大量培养时，可不必考虑无菌条件。
一、目的
学习藻类的分离和培养方法
二、药品、材料和用具
水生生物培养槽，玻璃片（面积稍大于培养槽），橡皮管，显微镜，三角烧瓶，试管，筛绢，棉塞，微吸管，凹玻片，灭菌锅，载玻片，吸管，培养皿，人工光源，木盆（或小型实验池），充二氧化碳气钢瓶，抽气泵，离心机。
土壤抽出液，青霉素，链霉素，琼脂，硝酸钙，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，过磷酸钙，硫酸镁，氯化钾，碳酸钠，三氯化铁，硅酸钠，葡萄糖，蛋白胨，硫酸铵，硝酸铵，氯化钙，碳酸氢钠，钼酸，氯化钠，柠檬酸铁，硫酸锰，人尿，海泥抽出液，食盐。
三、操作
生长在静水或水流缓慢河流中的藻类，培养比较容易。取到实验室后，要立刻从材料瓶中移到宽大的水生生物培养槽内。为了培养大的丝状藻，要利用宽的、不高的容器。这些容器要用玻片盖住，以防止培养物受灰尘沾污。倒入容器的水要达到容器高度的一半，或稍多些，使水面上还有充分空气。在容器边缘，要用一小块纵切橡皮管垫住，可使玻片不致紧贴容器，空气才能进入容器中。细微的藻类如团藻目、硅藻门能很好地生活于培养皿中。很多藻类如颤藻属、水绵属的若干种、轮藻属等可在实验室中保存很多年。
在迅速流动水中生长的藻如丝藻属、毛枝藻属等比较难于培养，因为它们要求经常输入氧气。在水层较高水中，在高容器中，这些藻类迅速地死亡。为了把这些藻类保存到实验时，应当把它们分成一些小部分，放在水层较薄的、宽的容器内，并须常常换水，把空气吹入水中。还可以用橡皮管把水生生物培养槽和水龙头连结起来，建立有流水的水生生物培养槽。
在水生生物培养槽中培养藻类时，应尽可能创造和保持藻类天然生存条件。把藻类培养在从采集藻类那一水域取来的水中，或其他天然水（尤其不能用自来水，因其中含很多氯气，必要的话，也须置较长时间，或加以煮开），或在水中加入混合养料，这些养料是由制造有机物质所必需的矿质盐构成。
在夏季，不要把藻类培养物放在直射太阳光下，而要放在凉爽的场所，例如向北窗台上。在秋、冬季节，如希望藻类保持积极生活活动状态，就要把培养物移到有人工光照处。
以上是一般藻类粗放的培养、保存方法。如要作较深入实验，需注意以下问题：
1．藻种的分离
藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。
真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。
（1）采样和预备培养：首先要采集有需要分离藻类的水样，采回后在显微镜下检查。如发现需要分离的藻类数量较多时，可立即分离。若数量很少，最好先进行预备培养，待其增多后，再分离。
用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。
可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。
有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。
土壤抽出液制作方法：先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）。再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天。由于气泡上升，棉塞可能弄脏。因此，最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌。
（2）分离方法：常用下列四种。
1）微吸管（毛细管）分离 选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20～30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000～5000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。
此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。
2）水滴分离法 用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2～4滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复重做，直到达到目的。
此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。
3）稀释分离法 把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。
首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。
此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。
4）平板分离法 这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。
接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。
此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。
5）底栖藻的分离 在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。
6）分离浮游蓝藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。
用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。培养时，每天轻轻摇动1～2次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。
2．藻种的培养
获得单种培养后，一方面扩大培养，另一方面可把藻种作较长时间保存，需要时随时取出使用。藻种培养要求比较严格，培养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量有100、300、500、1000毫升，适于逐渐扩大培养。培养容器和工具需经煮沸灭菌或使用化学药品灭菌后，用煮沸水冲洗，培养液用加热灭菌法灭菌。按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。大约二周后进行一次移植。藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。
3．藻种的保藏
可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏几个月。保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为1～1.5％。也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。
4．培养液和培养基的配方
配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种：
水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。
从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：
（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。
（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。
（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。
（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。
（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。
（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培养过程
包拈接种、培养、采收等。
（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。尤其是能运动种类，此时明显向上浮游，接种时可把上浮优质藻类吸出做藻种，起选种作用。
（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：
1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。
2）光照强度 利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦电灯或日光灯），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）温度 适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。
4）无机营养 应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。
5）注意pH变化 如变动过大，可用酸、碱调节。
6）适当控制培养物中藻细胞浓度 过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范围内。
7）及时观察和检查藻类生长情况 可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种和中继培养每半月进行一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细胞生长情况，并检查有无敌害生物污染。
（3）采收：培养液中藻体的适时采收，既是培养的目的，也是继续培养的手段。因为通过采收一部分藻体，可使藻细胞浓度保持恒定。通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。
采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、烘干。在大型培养池中采收藻体，可另外设计适当的工艺流程。
第三篇：微生物的分离与培养
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒
灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一)热力灭菌
热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌
(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。
(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
(二)过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：
(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。
(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：
① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。
② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。
(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。
注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。
此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。
(四)化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。
消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
二、培养基的制作
1、目的要求
了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。
2、基本原理
在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。
根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。
根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。
在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。
3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。
试剂 葡萄糖、琼脂等。
仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。
4、操作步骤
PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。
在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。
(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。
(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。
提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。
提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。
(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。
正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。
(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。
(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。
(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。
PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
三、病原菌的分离培养和纯化
1、目的要求
(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
2、基本方法
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
3、材料、仪器与用具 3.1 材料
(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。
(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。
(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。
3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。
4、实验操作
(一)病原真菌的分离
1．组织分离法 其步骤为：
(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。
（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。
（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。
2.稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。
(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。
(二)病原细菌的分离
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状
1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察
(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
第四篇：病原菌分离培养总结
病原菌的分离培养方法
一、基本原理
植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
二． 病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。
（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。
2.组织分离法
（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。
（6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
（7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；
（8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可保存。
三． 病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变“V”字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。
（2）培养基的准备:PDA，后划线纯化NB；
（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70％酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。
2.黑腐病菌分离（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取萝卜黑腐病块茎，用75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。
（4）将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
（5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防），分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28℃左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。
四．资料查询其他分离培养方法
1.病原真菌 稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。
(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化开冷却到45～50C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50C。
(5)将培养皿翻转后置恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。
2.病原细菌
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：
(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30C恒温箱中2—4h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。
(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28C恒温箱中培养。1—3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
五． 常用的几种典型的病原菌分离方法
1．斑点病原菌的分离。从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离。将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法。能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7．土壤带菌分离法。为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
第五篇：香菇实用栽培技术
香菇实用栽培技术
（一）、栽培季节
香菇一年生产一次，可在春季生产，也可在秋季生产。春季生产，1-4月接种，6月底转色基本结束，7-8月越夏，9至翌年2月出菇，秋季生产，7月下旬-9月上旬接种，11月翌年5月出菇，其栽培方式主要有段木栽培、袋装栽培（人造菇木）、搭架压块栽培等。下面主要介绍袋装栽培技术。
（二）、培养料及配方
栽培香菇的原料以杨、桦等阔叶树木屑为适宜，苹果、梨等果树的枝梢也可搭配使用，栽培香菇的原料配方并没有十分严格的标准，一般掌握的原则是木屑80％左右，麸皮10-20％，石膏或石灰1％，糖1％，其常用配方有：
1、杨（桦）木屑100公斤，麸皮20公斤，红糖1公斤，石膏2公斤，磷酸二氢钾0。5公斤，硫酸镁0。5公斤，石灰0。5公斤，水125公斤。
2、杂木屑80公斤，果木屑20公斤，麸皮20公斤，红糖1公斤，石膏2公斤，磷酸二氢钾0。5公斤，石灰0。5公斤，水125公斤。
3、杂木屑70公斤，棉壳30公斤，麸皮20公斤，石膏2公斤，磷酸二氢钾0。5公斤，硫酸镁0。5公斤，水125公斤。
（三）拌料装袋
配料时要按比例称量好原料，充分混拌均匀，加水量控制在混合料的含水量达到55％左右，生产中应宁干勿湿的原则，一般加水使料充分混合后用手握料能成团，松手后开裂，手掌心能见水印，在实际生产中应根据选用木屑的干湿程度决定科学的加水比例。装袋时采用机械和工人相结合的方法，保证袋内料松紧适度，不留空隙，用手按有弹性，不能太实，也不能太松，手指轻按不能有指窝。
（四）灭菌和接种
从拌料装袋到灭菌应在6小时内完成。灭菌时袋子要合理排放，留有一定空隙，以有利于培养基受热均匀，防止出现灭菌死角。高压灭菌在0.015兆帕压力下保持两小时；常压灭菌要求温度上升快，在100℃下保持10—12小时，闷锅8小时，以彻底灭菌。
接种时开放式和封闭式均可，但要注意：(1)要对整个环境用福尔马林、高锰酸钾和来苏儿原液进行彻底消毒。(2)接种的速度要快，以防杂菌混入和感染
（五）培菌期管理
冬春栽培时气温低，接种后以增温促快发早定植为主，菌袋排放可以堆高一些，可摆10－15层高，但排与排之间要留有空隙，当气温升高时再转换成“井”字形排放。接种后前一周内要想法使料温达到24－26℃，促进香菇菌丝早萌发，早定植，若气温太低，应考虑加温。
随着香菇菌丝的定植和发育，料内温度会高出室温3-7℃，这时要降低菌袋的堆放高度，并测定料内温度，防止料温升高超过28℃，春末接种时尤其要注意。
当接种穴的菌丝发展到3cm左右时，即可将外袋脱掉，并在接种穴周围菌丝处扎小孔，每穴周围3－4个小孔，深度1cm左右。这项工作要结合翻堆进行。刺孔后菌丝生长速度加快，料内温度上升，注意观察料内温度，根据室内气温高低适当菌袋堆放高度，防止料温超过28℃。
接种后30天左右，接种穴与穴菌丝已基本相连，可进行第二次制孔，孔深
1．5-2cm。正常情况下50天左右菌袋即可发满菌丝。
（六）菌筒转色期的管理
菌丝袋满后，有部分菌袋形成瘤状突起，表明菌丝将要进入转色期。转色期管理的最关键条件是温度，转色的最适宜料温是18－23℃，低于15℃，高于25℃菌丝都不能正常转色。
春栽香菇的菌袋要求在越夏之前转色完毕，管理要求是搞好通风，勤翻袋，使菌袋转色一致。
（七）出菇期间管理。
菌筒正常转色后，在自然温度下，几天后可看到子实体原基。这时要加强出菇期管理。
湿度：喷水不能过度，棚内温度以75-90%为宜，在原基出现前不要喷水。温度：昼夜温差5-8℃，平均温度15-20℃。这样长的菇肉厚品质好。空气和光照：香菇和其它食用菌一样喜欢新鲜空气，因此在管理中要结合喷水，适时通风，香菇菌筒转色和子实体生长需要一定的光照，这一点又与其它食用菌不同。
由于袋栽法（人造菇木）是一次接种，秋、冬、春季长菇，各季的气温条件不同，因此，在管理上又有区别。
1、秋菇：多出现在12月之前，接种后90天左右出菇，这个阶段，气温多变，高低不稳，要控制好出菇适温，若温度在20℃以上时，在早晚揭膜通风散热，低于12℃，可以拉帘增加热源。湿度管理上可进行干湿交替，一天大部分时间湿，少部分时间干，菇多要湿，每茬采完后要干。
2、冬菇：多在1-2月发生，这个季节气温寒冷，出菇少，但菇的品质好，价格高，这时要提高菇床温度，创造出菇条件。白天拉掉全部草帘，以提高棚内温度，晚上放帘保温。中午气温高时通风，并缩短通风时间，以20分钟左右为宜，减少喷水，控制湿度。
3、春菇：3-6月采菇，这个阶段春回大地，气温逐渐增高，菌丝恢复生长，但由于经过秋冬两季出菇，菌筒含水量降低，要及时补水（用补水器），棚内增加湿度（85%）。
二00九年四月八日
