第一篇：基因工程在植物育种中的应用及其安全性简介

基因工程在植物育种中的应用及其安全性简介

摘 要 基因工程是通过DNA重组技术，获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工程生物体。基因工程在农作物育种中得到了广泛的应用，尤其在抗虫、抗病、抗除草剂等新品种选育方面已取得较大成果。但基因工程自身存在安全性的问题，在享受基因工程带来的福祉的同时，应加强对基因工程安全性的监管。

关键词：基因工程、育种、安全性

基因工程作为生物技术的核心内容，已成为现代高新技术的标志之一。目前，基因工程领域的研究与开发工作十分活跃，新成果不断涌现，发展日新月异。经过几十年的发展，基因工程技术已走出实验室，基因工程技术的应用已发展成为一个巨大的产业，不仅科研机构进行研究和开发，很多商业机构也积极参与。基因工程在农业、医药、食品、环保等领域已显示出巨大的应用价值。

植物基因工程技术是利用重组DNA技术，有计划地在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物基因进行改造和从新组合，然后再插入、整合到事先准备好的受体植物基因组中，使重组基因在受体细胞内表达，从而使受体植物获得新的性状，培育出高产、多抗和[1]优质的新品种。利用植物基因工程技术可以更方便地对更多基因进行有目的的操作，打破自然界物种间难以交配的天然屏障，将不同物种的基因按人们的意志重新组合，拓宽了植物可利用的基因库，为创造新种质资源，培育植物新品种开辟了新的技术路线。必将在作物育种和品种改良中发挥重要作用。

1.基因工程的定义

所谓基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖的技术。或者说，基因工程是对DNA(脱氧核酸)大分子上的遗传单元(基因)进行体外操作，把不同来源的基因按照单元设计的蓝图，重新构成新的基因组合(即重组体)，再把它引入细胞中，构成具

[2]有新的遗传特性的生物。这种DNA 分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创新生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程的第二个特征是，一种确定的DNA 小片断能够在新寄主细胞中进行扩增。正是由于具备了这种特征，我们才能够制备到大量纯化的DNA 片段，从而拓宽了分子生物学的研究领域，包括核苷酸的序列测定、位点特异的突变形成，以及以确保所编码的多肽链能够在寄主细胞中实现高水平表达为目的的基因序列操作等。

植物基因工程是指植物学领域的基因工程，其研究对象是植物。植物基因工程的研究始于20世纪70年代。在基因突变和有性杂交研究的基础上，拓宽植物可利用的基因库，进行基因转移，采用分子生物学和基因工程技术将外源基因有目的、有计划地插入、整合到事先准备好的受体植物基因组中，使其在后一植株中得以遗传和表达，从而使受体植物获得新的性状，培育出新的优良品种。近20年植物基因工程研究成果显著，在当前农业生产中已显

[3] 示出巨大的经济效益，并展示了植物基因工程在未来农业生产中的广阔前景。植物基因工程不断发展，目前已形成了一套较为成熟的植物基因转化技术，它构成了植物基因工程的研究内容，主要又包括了以下几个方面：1)目的基因的获取:供植物基因转化的基因可以来自植物本身，也可以来自微生物和动物，少数还可以人工合成，通常以来自植物本身为主。它有一些常见的技术如PCR技术、转座子示踪技术、基因组相减技术、染色体步查技术。2)目的基因的修饰。3)目的基因转化到植物受体细胞的方法如：将目的基因与运载体结合，实际上是不同来源的DNA重组过程。直接转移法。聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等尤其是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物。电击法、基因枪法等是常用的方法。此外，还有激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法等。4)植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养:目前，转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因，即筛选标记基因和筛选试剂。为了实现有效的转化，必须依据转化材料和转移方法选择合适的抗性基因和筛选试剂。5)目的基因的表达和鉴定等

2.基因工程在植物育种中的应用 基因工程技术作为育种工作的一个突破，拓宽了作物可利用的基因库，按照人们事先计划好的方案引发定向变异已成为现实，给植物育种带来了变革。基因工程在植物育种中的以下几个方面得到了较为广泛的应用。

2.1基因工程在培育抗虫作物品种中的应用

虫害严重影响农业生产，影响作物的产量和品质，制约农业经济的稳定发展。全世界粮

[4]食产量因虫害所造成的损失占14%左右。采用化学药剂虽然是目前普遍使用的治虫方法之一，但由于特异性不高，具有一定污染性等原因，一直困扰着现代农业的发展。采用生物技术，提高作物自身的抗虫害性能，为农作物害虫的无公害防治开辟了新的途径。目前，在农作物上普遍通过根癌农杆菌、发根农杆菌、花椰菜花叶病毒等为中介的基因工程方法，将一些抗虫基因苏云金杆菌抗虫毒素基因(Bt毒素基因)、菜豆抗虫蛋白基因(胰蛋白酶抑制的CPTI基因)、蓼草抗虫基因等导入水稻、玉米、棉花、马铃薯、烟草、番茄等作物细胞，并使表达这些外源抗虫基因的转基因植株得到再生，有的投入大田实验。如含Bt的烟草能有效地阻止烟草天蛾幼虫的危害。在转基因玉米植株中，玉米螟取食死亡率可达 70%。培育成功的抗虫番茄植株，对危害番茄果实的烟草天蛾和烟草夜蛾幼虫的防治效果达100%，对棉

[5]铃虫也有很好的杀虫作用。国外正在研究的转Bt抗虫作物还有大豆、油菜、苜蓿、多种蔬菜及杨树等多种树木。由此表明，应用生物技术改良某些作物的抗虫性具有很大的潜力。

棉花是世界重要的经济作物之一，每年由于棉铃虫、红铃虫的危害，一般减产10%左右，高的达30%以上。施用化学农药防治，不仅耗资巨大，增加生产成本，而且容易引起环境污染、杀死害虫天敌、破坏生态平衡。采用生物防治，虽然能减轻对环境污染，但也有在大发生年份防效差等局限性。因此，利用基因工程将苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫基因导入棉花品种中，将培育出具有抗虫性能的棉花品种，成为当今防止棉铃虫、红铃虫最为先进、安全与经 济有效的手段。

2.2基因工程在培育抗病作物品种中的应用

病害是植物产量降低的一个重要原因。产生病害的原因是由于植物对病原菌抗菌机理复杂，因而使相应抗病基因的克隆困难，给植物基因工程抗病菌的研究带来了难度。抗细菌病害基因工程的主要策略:一是利用非植物的抗菌蛋白，包括昆虫裂解肽、溶菌酶和其它抗菌肽。抗菌蛋白能杀死大多数细菌，目前已克隆了一些抗菌蛋白基因并在植物体内得到表达。二是增强植物本身的抗病能力。激发子是能够被植物识别并能激发植物防疫机制的信号分子。在马铃薯中，已通过基因工程手段产生激发子来提高抗病性。

真菌性病害是另一类主要病害。植物抗真菌性病害基因工程的主要策略:一是基于寄主-病原菌相互识别和信号传导体系的基因工程，其中主要是抗病基因(R基因)的转移。应用分子标记和图位克隆，目前已克隆了数十个R基因。由于多数R基因的抗性十分专化，不仅抗病谱窄，而且抗性容易丧失，因此发现和克隆持久抗性的基因具有重要意义。二是基于抗真菌蛋白的基因工程策略，包括几丁质酶和葡聚糖酶，病程相关蛋白(PR蛋白)和核糖体失活

[6] 蛋白(RIP)，抗真菌多肽，草酸氧化酶和葡萄糖氧化酶。

2.3基因工程在培育抗除草剂作物品种中的应用

抗除草剂转基因作物的选育首先是作为一种杂草防除对策而提出的。通过化学方法来控制杂草己成为现代化农业生产中不可缺少的一部分。但除草剂在杀死杂草的同时污染环境，有的对农作物产生预想不到的影响。而通过基因工程，将除草剂耐性基因导入作物，增加了对除草剂的选择性和安全性，就能有效解决这些问题。目前，世界上采用的除草剂主要分为两大类:(l)通过破坏氨基酸合成途径来杀死杂草，Monsanto公司的除草剂多为此类。如草甘膦，它是目前用得最广的一种非选择性除草剂，可杀死世界上78种恶性杂草中的76种，对人畜无毒，且易为土壤微生物分解。20世纪80年代，美国Monsanto公司率先开展抗除草剂转基因作物的研究，育成了一系列抗草甘膦的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、向日葵[7]品种。(2)通过破坏植物光合作用中电子链的蛋白来杀死杂草。

抗除草剂基因工程育种主要有两条途径：一是修饰除草剂作用的靶蛋白，使其对除草剂不敏感，或促其过量表达以使植物吸收除草剂后仍能正常代谢；二是具有抗草丁磷特性，是在作物中导人了从吸水链霉菌中克隆的抗草丁磷(PPT)基因(bar)，能将PPT转化为无毒的乙酞化形式。由于bar基因等抗除草剂基因本身亦可作为植物转化过程中的抗性标记，因此许

[8] 多具有其它改良性状的转基因油料作物同时也拥有杭除草剂特性。

3.植物基因工程的安全性评价

基因工程在农业等领域已显示出巨大的应用价值。但从人类历史发展的经验来看，科学技术给人类社会带来福音的同时，都潜在着对人类自身或生存环境造成危害的一面，基因工程也不例外，在开展基因工程应用的同时，也要注意到其潜在的危害，加强安全性管理。早在七十年代，基因工程安全性问题就引起了广泛的讨论，人们已注意到基因工程对生态环境、人类健康、社会经济等可能带来的一些问题。

3.1基因工程对生态环境的影响

地球的生命已经存在了三十多亿年，简单的生命经过漫长的进化过程，形成了今天地球上由千万种生物所组成的复杂生态系统。采用基因工程的手段改造生物体，就有可能过快打乱自然界经过漫长时间进化所形成的秩序，破坏生态平衡。转基因生物的代谢产物会向外界环境扩散，造成链锁反应，凭目前的生物技术发展水平，还不能准确预测基因工程生物体及其代谢产物的表现形态和潜在危害，也难以提出针对性的防范措施。基因工程对生态系统的危害主要体现在：基因漂移；对非目标生物产生危害；产生有害生物，危害生物群落等问题上。

3.2基因工程对人类健康的影响

很多经基因改造的农作物经过加工成为食品，虽然基因工程技术可大大提高食品的产量和质量，但也可能引起食品成分非预期的改变，对食用者的健康产生潜在的危害。这体现在:是否会含有新的过敏原，抗昆虫农作物是否含有残留的抗昆虫内毒素，抗除草剂农作物是否最终导致除草剂用量增加，引起除草剂在食品中残留。抗病毒农作物中含有的病毒外壳蛋白基因是否会对人体造成危害。

3.3基因工程对社会经济的影响

开发基因工程产品需要巨大的经费投入，如开发一种转基因农作物，需要经过试验室研究、中间试验、环境释放、商品化生产等环节，为保证商业利益，基因工程作物种子往往价格昂贵，并且有专利保护，使农业生产高投入、高产出的趋势更明显，发展中国家和贫穷国家由于资金不足，防碍转基因作物的开发与应用，随着转基因产品数量增加，对发达国家的[9] 依赖程度也会增加，可能使贫富差距拉大，引起新的发展不平衡。发展中国家和落后国家在基因资源的利用方面也处于不利地位。宝贵的基因资源谁先发现，谁就可以申请专利而得到保护。基因资源是有限的、不可再生的，在基因资源的争夺战中，发达国家凭借其资金和技术占尽先机，通过所谓“合作研究”获取其他国家的基因资源。这使得未来在基因资源利用、开发具有自主知识产权的转基因产品方面，发展中国家和贫穷国家越来越处于被动地位。

4.展望

近20年来，基因工程的发展日新月异，硕果累累。基因转化技术的日臻成熟，使育种途径进入一个高新时代。大量转基因作物的研究表明，作物基因工程是在基因水平上改造作物的遗传物质，定向改造了作物遗传性状，扩展了育种范围，打破了物种间的生殖隔离障碍，丰富了基因资源。从而使育种更具有科学性、精确性、目的性、共用性和可操作性。新基因的克隆和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，有望出现高产优质、集高光效、抗病、抗虫和抗逆等特性于一身的作物新年品种。一些重要有经济价值的转基因植物已陆续进入大田，并取得了较好的经济效益、社会效益和环境效益，在解决人类所面临的资源短缺、环境恶化和效益衰退三大难题中显示出越来越重要的作用，为农业的持续、稳定发展提供了强有力的保障。但科学是一把双刃剑，基因工程在为人类创造福祉的同时也带来了诸如基因工程产品的安全性等问题。

同时，我们不能错过这一新技术革命带来的发展机遇。应充分利用我国丰富的基因资源，积极稳妥开展基因工程研究与应用，慎重与灵活相结合，加强安全性管理。使我国基因工程 研究和应用走上健康发展的道路，在世界高新技术领域占一席之地。

第二篇：基因工程在食品工业中的应用

基因工程在食品工业中的应用

摘要：生物技术发展日新月异，基因工程的应用已经渗透到工、农、衣、国防和环保等各个领域，深刻影响着人类的生活和社会的进程；当然，基因工程技术在食品中的应用也越来越广泛。它具有从本质上改变生物及食品性能的特性，因此越来越受到食品科技工作者的重视。本文阐述了基因工程的定义，详细介绍了基因工程食品的由来，并介绍了基因工程在食品原料改良中的应用；基因工程在食品发酵中的应用；基因工程在农副产品加工中的应用，同时，展望了基因工程技术在食品工业领域中的美好发展前景。

关键词：基因工程

食品工业

食品原料改良

食品发酵

农副产品

Application of genetic engineering in food industry Abstr act: Changing biotechnology and genetic engineering applications have penetrated into industry, agriculture, national defense, clothing, and the environmental protection and other fields, and deeply influenced the process of human life and society;Genetic engineering application in the food, of course, also more and more widely.It has essentially changed biological and food performance characteristics, so more and more brought to the attention of the food science and technology workers.This paper expounds the definition of genetic engineering, gene engineering was introduced in detail the origin of the food, and introduces the application of genetic engineering in food raw material improvement;The application of genetic engineering in food fermentation;Genetic engineering application in the agricultural and sideline products processing, at the same time, discussed in the field of genetic engineering in food industry good development prospects.Key word: Genetic engineering

food industry

food raw material improvement

food fermentation

agricultural and sideline products

一、基因工程的定义

狭义：指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；

广义：指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。

基因工程食品: 基因工程食品是指利用生物技术改良的动植物或微生物所制造或生产的食品、食品原料及食品添加剂等。它是针对某一或某些特性以突变、植入异源基因或改变基因表现等生物技术方式，进行遗传因子的修饰，使动植物或微生物具备或增强此特性，进而降低生产成本，增加食品或食品原料的价值，例如增强抗病性、改变营养成分，加快生长速度、增强对环境的抗性等

二、基因工程的发展史 基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

三、基因工程在食品原料改良中的应用

（一)水化合物的改良

食品碳水化合物类食品方面利用基因工程来调节淀粉合成过程中特定酶的含量或几种酶之间的比例，从而达到增加淀粉含量或获得独特性质、品质优良的新型淀粉。例如：通过反义基因抑制淀粉分枝酶可获得完全只含有直链淀粉的转基因马铃薯。这样油炸后的产品更具有马铃薯的风味，更好的构质，较低的吸油量和较少的油味。

(二)油脂的改良

目前，控制脂肪酸链长的几个酶的基因和控制饱和度的一些酶的基因已被克隆成功，并用于研究改善脂肪的品质。如通过导入硬脂酸-ACP 脱氢酶的反义基因，可使转基因油菜 种子中硬脂酸的含量从 2%增加到 40%。而将硬脂酞 CoA 脱饱和酶基因导入作物后，可使转基因作物中的饱和脂肪酸(软脂酸、硬脂酸)的含量有所下降，而不饱和脂 肪酸(油酸、亚油酸)的含量则明显增加，其中油酸的含量可增加 7 倍。除了改变 油脂分子的不饱和度外，基因工程技术在改良脂肪酸的链长上也取得了实效。事实上，高油酸含量的转基因大豆及高月桂酸含量的转基因油料作物芥花菜(Canola)在美国已经成为商品化生产的基因工程油料作物品种。

(三)蛋白质的改良

食品中动植物蛋白由于其含量不高或比例不恰当，可能导致蛋白营养不良。采用转基因的方法，生产具有合理营养价值的食品，让人们只需吃较少的食品，就可以满足营养需求。例如，豆类植物中蛋氨酸的含量很低，但赖氨酸的含量很高；而谷类作物中的对应氨基酸含量正好相反，通过基因工程技术，可将谷类植物慕冈导入豆类植物，开发蛋氨酸含量高的转基因人豆。

（四）碳水化合物的改良

对碳水化合物的改进，只有通过对其酶的改变来调节其含量。高等植物体中涉及淀粉合成的酶类主要有: ADPP葡萄糖焦磷酸酶(ADP-GPP)、淀粉合成酶(SS)和分支酶(BE)。通过反义基因抑制淀粉分支酶，可获得完全只含直链淀粉的转基因马铃薯。Monsanto公司开发了淀粉含量平均提高了20%-30%的转基因马铃薯。油炸后的产品更具马铃薯风味、且吸油量较低。

四、基因工程在食品发酵中的应用

随着食品工业的发展，对酶、蛋白质、氨基酸、香精、甜味剂等原辅料的需求量大增，而这些原辅料传统上靠动植物供应，由于受气候、季节、生长期等因素的影响，供应鼍往往不能满足需要。现在基因工程技术已能将许多酶、蛋白质、氨基酸和香精以及其他多种物质的基冈克隆入合适的微生物宿主细胞中利用细菌的快速繁殖来大量生产。例如将牛胃蛋白酶的基因克隆入微生物体内，由细菌生产这种动物来源的酶类，将解决奶酪工业受制于凝乳酶来源不足的问题；从西非发现的由植物果实中提取的甜味蛋自质(thaumatin)的DNA编码序列已经被克隆入细菌，以生产这种高效低热量新型甜味剂等。下面重点介绍基因工程程在啤酒工业、乳品工业方面的应用。

(一)啤酒工业

1、大麦的选育：

利用RF[，P(限制性片断长度多样性)技术对人麦进行抗病选育、Q一淀粉酶多基因族分析大麦醇溶蛋白的研究及品种鉴定。利用转基因技术将外源基因直接导入大麦，用于品种改良、抗虫和抗病选育，人们期待着基因重组技术能产生耐枯斑病等病害的大麦品种。

2、啤酒稻的选育：

大米是啤酒酿造中使用最广的辅料，但普通大米的用帚提高到30％以上时，麦汁中Q一氨基氮含量会不足而影响酵母的正常生长和发酵。利用基因转移技术、细胞融合技术等选育高蛋白、低脂肪、低NSP(非淀粉多糖)的稻品种，专门用于啤酒酿造，进一步提高辅料比例，降低生产成本。

3、啤酒酵母的改造：

利用粮食替代晶酿造啤酒的首选原料是纤维素因为纤维素自然界存量最多的有机物，某些真菌如平菇、香菇、灵芝、红曲霉等对纤维素有很强的分解能力，如果利用现代基因工程技术将这些真菌中控制纤维素酶，合成的基阗转移到啤酒酵母中去，那么啤酒酵母就能利用纤维素酿造啤酒，改变传统的啤酒生产中消耗大量的大麦和大米等粮食的局面。

(二)乳品工业

l、提高牛乳产量：

将采用基因工程技术生产的牛生长激素(BST)注射到母牛上，可提高母牛产奶量。目前利用DNA的克隆繁殖技术，把人垂体激素(ST)重组体互)陋UBST的mRNA中，利用外源BST来注射乳牛，可提高15％左右的产奶量，BST现已进入商业化领域。现在英、美等国都已采用BST来提高乳牛的产奶量，具有极大的经济效益，且对人体无害。

2、改善牛乳的成分：

利用13一半乳糖苷酶水解乳中的乳糖，对众多乳糖不耐症者是一个难得的好产品。可将编码通过基因工程技术将B一半乳糖苷酶基因转入GRAS级的微生物细胞作为宿主，在宿主调节基因的调控下，在发酵罐规模上生产表达有优良特性的13一半乳糖营酶基因。此外，针对矿乳白蛋白的mRNA，用核酸编码的转基因，使与乳糖合成有关的a_乳白蛋白(是乳糖产生的催化物质)的基因被淘汰，以此达到降低乳中乳糖含量的目的。

五、基因工程在农副产品加工中的应用

改良果蔬采收后品质增加其贮藏保鲜性能 随着对番茄、香蕉、苹果、菠菜等果蔬成熟及软化机理的深入研究和基因工程技术的迅 速发展，使通过基因工程的方法直接生产耐储藏果蔬成为可能。事实上，现在无论在国外还 是国内都已经有了商品化的转基因番茄。促进果实和器官衰老是乙烯最主要的生理功能。在 果实中乙烯生物合成的关键酶主要是乙烯的直接前体—l-氨基环丙烷一 1-梭酸合成酶(ACC 合成酶)和ACC 氧化酶。在果实成熟中这两种酶的活力明显增加，导致乙烯产生急剧上升，促进果实成熟。在对这两种酶基因克隆成功的基础上，可以利用反义基因技术抑制这两种基 因的表达，从而达到延缓果实成熟，延长保质期的目的。因此，利用反义基因技术可以成 功的培育耐储藏果蔬。目前，有关的研究正在继续进行，并已扩大到了草莓、梨、香蕉、芒 果、甜瓜、桃、西瓜、河套蜜瓜等，所用的目的基因还包括与细胞壁代谢有关的多聚半乳糖 醛酸酶(PG)、纤维素酶和果胶甲脂酶基因。反义PG 转基因番茄还具有更强的抗机械损伤和 真菌侵染能力，且有更高的果酱产率。

（六）、展望

目前，包括我国政府在内的各国政府对基因工程技术在农业和食品工业中的应用都制定了相关的管理条例，因此只要合理地使用，基因工程技术将是发展绿色食品产业的有效手段。基因工程技术是一门诞生不久的新兴技术，正如其它一些新技术的产生过程一样，由于人们一开始对新技术的了解程度不够，由此而产生的疑虑和争论是可以理解的，更何况基因工程技术研究的产品与人类健康息息相关。虽然现在对基因工程技术仍有许多争论，但目前科学界已基本上达成共识，即基因工程本身是一门中性技术，只要能正确地使用该项技术就可以造福于人类可以预言，在2l世纪，以基因工程为核心的生物技术必将给食品工业带来深刻的革命

参考文献

[1]林影、石磊、杜红丽.食品与基因工程.北京.化学工业出版社,202_.10 [2]周如金，郭华，彭志英.基因工程及其在食品中应用[J].202_，4:33．

[3]杨淑芳.发酵工程在农产品加工上的应用[J].农业工程技术，202_，(12)：1l-13． [4]江梅.生物技术的应用[J].生物学通报，1996，6：4-8．

[5]何水林.郑金贵.农业生物技术在作物品质改良中的应用[J]．福建农业大学学报,202_,(3):2O [6] 陈宗道,赵国华,李洪军等.食品基因工程研究进展[J].中国食物与营养，202_，4：14-16． [7] 汪秋安．基因工程食品[J]．广西轻工业，202_，6：5-6．

[8] 郑铁松,何国庆,应铁进.基因工程技术在食品品质改良中的应用[J].食品工业科技,202_,21(4):70-72．

[9] 伊国等 基因工程在食品工业中的应用进展，食品科技，202_年02期 [10] 吴乃虎.基因工程原理[M].北京：科学出版社，1999．

[11] 李淑侠，齐凤兰，李伯林.基因食品的研究进展[J].食品科学，202_，21(3)：6-10． [12]彭志英主编．食品生物技术[M]．北京：中国轻工业出版社，1999．8：26-33． [13] 邵学良.刘志伟 基因工程在食品工业中的应用 [期刊论文]-生物技术通202_(7)[14]贾士荣．转基因植物的环境及食品安全性[J]．生物工程进展．1997，6：38-42．

[15]张建全，张倩，马建军.基因工程技术在视食品工业中的应用[J].山东农业科学，202_，2:106-108.[16] El—Khateib T，Yousef A E．Ockerman H W．Inactivation and attachment of Listeria monocytogenes on beef muscle treated with lactic acid and selected bacteriocins[J]．J．Food Protect，1993，56：29-33．

[17] Uzogara，Stella G The impact of genetic modification of human foods in the 2 1 st century：A review[J]．Biotechnology Advances，202_，1 8(3)：179-2O6．

[18] De Vefies AG，Faucitano L，Soenicki A.The use of gene technology for optimal development of pork meat quality[J]．Food Chemistry，202_，69(4)：397-405．

[19] Marc Van Montagu, Jeff Schell(1935-202_): Steering agrobacterium-mediated plant gene engineering[J].Trends in Plant Science , 200

[20] El-Khateib T,Yousef A E,Ockerman H W.Inactivation and attachment of Listeria monecytogenes on beef muscle treated with lactic acid and selected bacteriecins[J].J.Food Protect, 1993, 56: 29-33.

第三篇：基因工程在废水处理中的应用与展望

基因工程在废水处理中的应用状况及展望

摘要：本文对现代基因工程技术在污水生物处理系统中的应用进行了概述, 利用基因工程技术提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术。笔者就基因工程技术的原理、研究内容和在污水处理领域中的应用进行了阐述了，并对其研究方向作了展望。

关键字：基因工程，污水处理，应用

The application status of gene engineering technique to wastewater

treatment and its prospects

Abstract: The application of gene engineering technique in wastewater treatment process had been discussed in this paper, and gene engineering technique was the key technique for wastewater treatment by improving the purifying environment ability of microbes.The author formulated the principle, main research content of gene engineering technique, and the application of gene engineering technique in wastewater treatment, and discussed its research orientation in the end.Key words: gene engineering, wastewater treatment, application

生物法处理生活污水如今已被广泛的应用，但揭示污水中复杂微生态系统方面存在很大的局限性，并且有些特殊污水用自然界中自然进化的微生物难于降解，基因工程的引进开辟了培育高降解能力的新品菌种方法，利用基因工程技术检测微生物性状、提高微生物净化环境的能力是用于废水治理的一项关键技术。基因工程的定义

基因工程（genetic engineering）是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。

一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。（3）外源基因的导入。（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。（5）外源基因表达产物的生理功能的核实。（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析。（7）生态与进化安全保障机制的建立。（8）消费安全评价。基因工程技术在废水处理中的应用

环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。尤其是在污水处理方面，生物法逐渐成为废水处理的主要方法。但是由于废水的多样性及其成分的复杂性，自然进化的微生物降解污染物的酶活性往往有限。20世纪90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，就可以定向获得具有特殊降解性状的高效菌株，方便有效地应用于水污染处理。因此，构建基因工程菌成为现代废水处理技术的一个重要研究方向，且日益受到人们的重视。

2.1 基因工程技术在污水检测中的应用

2.1.1 聚合酶链反应(PCR)技术在污水检测中的应用

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术，PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数(通常为25~30个循环)，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。这种技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。PCR技术的基础是只有在微生物特定核酸存在的条件下，重复性酶促DNA合成和扩增才能够发生。PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳来检验和纯化，也可以被用来克隆、转化和测序.在具体应用中往往采用经过修正的或与其它技术联合应用的PCR衍生技术，如RT-PCR、竞争PCR、PCR-DGGE、PCR-SSCP和巢式PCR等。

PCR通过对待测DNA片段的特异性扩增，一方面作为菌株定性鉴定的重要手段，同时也为定性和定量研究微生物的群落特征提供帮助。自PCR技术问世以来，通过其自身的不断完善以及同其它相关技术的联用，在污水生物处理微生物的检测和鉴定方面得到了长足的发展，为该领域的研究提供了一个高效、灵敏、简便的研究工具。应用PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction Denaturing Gradient Gel Electrphoreses)方法对环境微生物进行研究可以不经过培养，直接从样品中提取细菌的DNA，再将编码有16SrDNA的基因进行扩增。通过这种方法能够直接了解样品中微生物分布结构，并能大致比较相同条件下单一菌群的生物量。王峰等采用PCR-DGGE技术来分析活性污泥与生物膜中微生物种群的结构，可以不经过常规培养而直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA；Marsh等利用PCR-DGGE分析并获得了活性污泥中真核微生物的种群变化情况；Nicolaisen等利用PCR-DGGE技术发现Nitrosomonas-like细菌是上流式好氧流化床颗粒污泥中的主要氨氧化菌。以上的事实均说明，PCR-DGGE结合测序技术是一种完全可行的适于环境样品微生物研究的快速分析方法。

2.1.2 荧光原位杂交技术(FISH)技术在污水检测中的应用

荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性，能够在自然的微生物环境中检测和鉴定不同的微生物个体，并提供污水处理过程中微生物的数量、空间分布和原位生理学等信息。FISH技术的基本原理是通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号从而对未知的核酸序列进行检测。

Nielsen等(202_)对工业废水处理厂活性污泥的细菌表面疏水性进行了原位检测，并应用FISH技术结合细胞表面微球体分析研究了丝状细菌的胞外聚合物。Konuma等(202_)运用FISH法来测定氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria)的数量，结果表明，FISH法对氨氮含量高的活性污泥混合液检测结果较好，但对氨氮含量低的污水厂出水和河水的检测效果不佳。表1列举了FISH技术的一些应用实例。

表1 FISH技术在废水中微生物检测的具体应用实例

Table1 The applications of FISHin the microorganism detections in wastewater 应用

检测活化污泥反应器中的Microthrix parvicella 在EBPR系统中,考察聚磷菌(PAOs)的微

生物特性和生化特性

探明废水处理湿地生物膜中影响氨氧化的主要功能菌群

揭示UASB反应器中高温和中温颗粒污泥的厌氧微生物群落的空间分布和多样性 鉴定了活性污泥中硝化细菌群落的数量和空间分布

SBR反应器内,不同电子受体条件下,反 硝化除磷菌(DNPAOs)的种群变化

文献来源（Eberlet al.,1997)(Minoet al.,1998)(Silyn-Robertset al.,202_)(Sekiguchiet al.,202_;Syutsuboet al.,202_)(Coskuneret al.,202_)(Johuanet al.,202_)

2.1.3 DNA重组技术在污水检测中的应用

DNA重组技术的实质是，将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。其基本程序是:外源DNA的获得；选择载体并进行处理；将目的DNA片段和处理后的载体连接；将连接产物导入合适的宿主细胞内，使重组DNA分子在宿主细胞内复制扩增；将转化菌落在平板培养基上培养成单个菌落，筛选获得含有重组DNA的阳性克隆。在废水的处理过程中仅靠分离和筛选的功能性微生物是不够的。在混合的微生物群体中筛选特定的微生物菌种时往往得不到预期的结果；特定的微生物可能难以培养，从而无法应用到实际的生物反应器中；人类排放到环境中的污染物越来越复杂且难以处理。因此，有必要通过基因工程技术并根据具体的需要构建有效的基因工程菌或培育出可高效降解复杂多样的有害污染物的细菌来解决以上的问题。

2.2 利用基因工程菌降解废水中的有机污染物

生物处理法是废水中有机污染物降解的主要方法，但是部分难降解有机污染物需要不同降解菌之间的协同代谢或共代谢等复杂机制才能最终得以降解,这无疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转运是耗能过程,对细菌来说这是一种不经济的营养方式；其次,某些污染物的中间代谢产物可能具有毒性，对代谢活性有抑制作用；此外,将不同种属、来源的细菌的降解基因进行重组,把分属于不同菌体中的污染物代谢途径组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力。

Satoshi Soda等[11]将基因工程菌P.putidaBH(pSl0-45)接种到SBR反应器的活性污泥中,用于处理500mg/L的苯酚废水,在大大提高苯酚去除率的同时改善了污泥沉降性能。南京大学、扬子石油化工有限责任公司、香港大学、国家环保总局南京环境科学研究所联合完成了跨界融合构建基因工程菌处理石化废水的生物工程技术。在优化调控技术的基础上,该菌株对二甲苯、苯甲酸、邻苯二甲酸、4-羧基苯甲醛和对苯二甲酸的降解率分别高达86%、94%、99%、97%和94%,比原工艺提高了20%～30%,总有机碳去除率达到了94%；污水经过处理后,铜、锰、锌、硒的浓度符合国家规定排放标准,生物毒性明显降低。

刘春等以生活污水为共基质,考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反应器中对阿特拉津的生物强化处理效果,以及生物强化处理对污泥性状的影响。结果表明,基因工程菌在MBR中对阿特拉津具有很好的生物强化处理效果,阿特拉津平均出水浓度为0.84 mg/L,平均去除率为95%,最大去除负荷可以达到70mg/(L·d)。生物强化的MBR对生活污水中COD的平均去除率为71%,COD平均出水浓度65mg/L。

吕萍萍等研究发现，克隆有苯降解过程中的关键基因——甲苯加双氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)对苯具有较高的降解效率和降解速度,应用于固定化细胞反应器中效果突出。在较短的水力停留时间内,可以将1500mg/L苯降解70%,降解速度为1.11mg/(L·s),延长水力停留时间,可以使去除率达到95%以上。该反应器对高浓度的苯具有突出的处理效果。同时所得到的产物为环己二烯双醇,可以被野生非高效菌W3快速利用。

2.3 基因工程技术在处理重金属废水中的应用

将基因工程技术应用于重金属废水的治理，就是通过转基因技术，将外援基因转入到微生物细胞中进行表达，使之表现出一些野生菌没有的优良的遗传性状。2.3.1基因工程菌强化生物化学法处理重金属废水

生物化学法指通过微生物处理含重金属废水,将可溶性离子转化为不溶性化合物而去除。硫酸盐生物还原法是一种典型生物化学法,该法是在厌氧条件下硫酸盐还原菌通过异化的硫酸盐还原作用,将硫酸盐还原成H2S,重金属离子和H2S反应生成溶解度很低的金属硫化物沉淀而被去除,同时H2SO4的还原作用可将SO2-4转化为S2-而使废水的pH值升高,从而形成重金属的氢氧化物而沉淀。中国科学院成都生物研究所从电镀污泥、废水及下水道铁管内分离筛选出35株菌株,从中获得高效净化Cr(VI)复合功能菌。

袁建军等利用构建的高选择型基因工程菌生物富集模拟电解废水中的汞离子,发现电解废水中其他组分的存在可以增大重组菌富集汞离子的作用速率,且该基因工程菌能在很宽的pH范围内有效地富集汞。但高浓度的重金属废水对微生物毒性大,故此法有一定的局限性,不过,可以通过遗传工程、驯化或构造出具有特殊功能的菌株,微生物处理重金属废水一定具有十分良好的应用前景。2.3.2 基因工程强化生物絮凝法处理重金属废水

生物絮凝法是利用微生物或微生物产生的具有絮凝能力的代谢物进行絮凝沉淀的一种除污方法。生物絮凝剂又称第三代絮凝剂，是带电荷的生物大分子，主要有蛋白质、黏多糖、纤维素和核糖等。目前普遍接受的絮凝机理是离子键、氢键结合学说。前述硅酸盐细菌处理重金属废水可能的机理之一就是生物絮凝作用。目前对于硅酸盐细菌絮凝法的应用研究已有很多[，有些已取得显著成果[7]。运用基因工程技术，在菌体中表达金属结合蛋白分离后，再固定到某些惰性载体表面，可获得高富集容量絮凝剂。

Mehran Pazirandeh等人将含金属结合肽(Cys．Gly．Cys—Cys．GIy)的基因与麦芽糖结合蛋白的基因进行融合，并将融合蛋白在E．coli细胞膜处表达，表达该融合蛋白的基因工程菌对人工合成废水中Cdz+和H +的去除率有很大的提高，Cdz 和H +的富集能力分别达到每毫克湿细胞1．1和1．3nmol，而对照菌株(缺少金属结合肽)的富集能力低于每毫克湿细胞0．1 nmol Masaaki Terashima 等利用转基因技术使 E.coli表达麦芽糖结合蛋白（pmal）与人金属硫蛋白（MT）的融合蛋白pmal-Ml并将纯化的 pmal-MT 固定在Chitopeara 树脂上，研究其对 Ca2+和 Ga2+的吸附特性，该固定了融合蛋白的树脂具有较强的稳定性，并且其吸附能力较纯树脂提高十倍以上。展望

自202_年，国际上提出基于系统生物学原理的基因工程概念后，基因工程被应用于社会各个领域，并且手段日新月异。在环境领域当中，基因工程正迅速应用到废水检测和废水治理当中，培养出新的特效物种并进一步提高其应用效率、降低应用成本。随着分子生物学技术、环境工程检测技术的发展并结合我们已经掌握的微生物群落结构和功能方面的知识,我们逐渐了解到污水生物处理系统中微生物群体的多样性、实际生存状态、功能特点,并更有效地对其加以开发和利用。此外，基因工程菌的出现，使以往的一些难降解有机废水、制药废水、石油废水、重金属污染废水以及其他有毒有害废水等都得到了有效地治理，还会实现废水资源化。当下引入DNA 扩增和其它生物技术的环境监测方法等将是基因工程技术研究的侧重方向。

基因工程技术作为一种新兴技术以极快的速度发展。以下两方面的研究将对水资源保护有着重要意义。一是对基因工程菌的深入研究,如基因工程菌对污染物的代谢途径、控制目的基因表达的启动子基因序列、降解基因表达的调控条件的优化等方面的研究；二是对环境中微生物的习性及基因工程菌与环境中微生物和污染物之间的相互作用进行研究。目前的研究主要是利用单一的基因工程菌对污染物进行处理,随着研究的不断深入,利用多种基因工程菌相结合对污染物进行处理,将对水资源保护起到更为重要的作用。参考文献

[1] 李向东，冯启言，于洪锋.基因工程菌在制药废水处理中的应用.工业水处理，202_, 28(8)：70-71.[2] 杨 林,聂克艳,杨晓容,高红卫.基因工程技术在环境保护中的应用.西南农业学报,202_,20(5):11-30.[3] 邢雁霞,刘斌钰.基因工程技术的研究现状与应用前景.大同医学专科学校学报,202_年第3期:48.[4] Johwan A, Tomotaka D, Satoshi T, et al.202_.Characterization of denitrifying phosphate-accumulating organisms cultivated under different electron acceptor conditions using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis assay [J].Wat Res, 36:403—412.[5] Leo E, Renate S, Aldo A, et al.1997.Use of green fluorescent protein as a marker for ecological studies of activated sludge communities[J].Fems Microbiology Letters, 149(1):20:77—83.[6] Marsh TL, Liu WT, Forney LJ.1998.Beginning a molecular analysis of the eukaryal community in activated sludge [J].Wat Sci Tech, 37(4—5):455—460.[7] Metcalf, Eddy, Inc.202_.Wastewater Engineering: Treatment and Reuse(Fourth Edition)[M].Beijing: Tsinghua University Press:129—130.[8] Mette H N, Niels B R.202_.Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)approaches to study the persity of ammonia-oxidizing bacteria [J].Journal of Microbiological Methods, 50:189—203.[9] Wang F, Fu Y G.202_.Characteristics of municipal sewage chem-bioflocculation treatment process by using PCR-DGGE technology[J].Environmental Science,25(6):74—80(in Chinese).[10] Wang J, Chicharro M, Rivas G,et al.1996.DNA biosensor for the detection of hydrazines[J].Anal Chem, 68(13): 2251—2254.[11] Zhang D, Zhang D M, Liu Y P,et al.202_.Community analysis of ammonia oxidizer in the oxygen-limited nitritation stage of OLAND system by DGGE of PCR amplified 16S rDNA fragments and FISH [J].Journal of Environmental Sciences, 16(5):838—842.[12] Sellwood J,Litton P A,Mcdermott J,et al.1995.Studies on wild and vaccine strains of poliovirus isolated fromwater and sewage [J].Wat Sci Tech, 31(5—6):317—321.[13] Selvaratnam S, Shoedel B A, Mcfarland B L, et al.1997.Application of the polymerase chain reaction and reverse transcriptase/PCR for determining the fate of phond-degrading Pseudomonas putida ATTCC 11172 in a bio-augmented sequencing bath reactor [J].Appl Environ Microbiol, 47:236—240.[14] SimonT.1999.PCR and the detection of microbial pathogens in water and wastewater[J].Wat Res,33(17):3545—3556.[15] Zhao, X.W., M.H.Zhou, Q.B.Li, et al.Simultaneous mercury bioaccumulation and cell propagation by genetically engineered Escherichia coli[J].Process Biochemistry,202_, 40(5):1 611-1 616.[16] Satoshi, S., I.Michihiko.Effects of inoculation of a genetically engineered bacterium on performance and indigenous bacteria of a sequencing batch activated sludge process treating phenol[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1998,86(1):90-96.[17] 陆杰, 徐高田, 张玲, 等.制药工业废水处理技术[J].工业水处理,202_,21(10):1-4.[18] 刘春,黄霞,孙炜,王慧.基因工程菌生物强化MBR工艺处理阿特拉津试验研究.环境科学,202_年2月,第28卷,第2期:417-421.[19] 袁建军,卢英华.高选择性重组基因工程菌治理含汞废水的研究.泉州师范学院学报(自然科学).202_年11月,第21卷,第6期:71-72.[20] Masaaki Terashima,Noriyuki Oka,Takamasa Sei，et o1．Biotech．no1．Prog．，202_，18：1318—1323．

[21] Caroliaa S，Pave[K,Tomas R，et ．J Bacterio1．，1998，180（9、：2280—2284． [22] 吕萍萍,王慧,施汉昌,等.基因工程菌强化芳香化合物的处理工艺.中国环境科学

202_,23(1)：12-15.[23] Mehran P，Bridget M W，Rebecca L R．App1．Environ．Microbio1．，1998，64(10)：：4068-4072.[24] 徐雪芹，李小明，杨麒，等.固定化微生物技术及其在重金属废水处理中的应用 [J].环境污染治理技术与设备，202_，7（7）：99-105.

第四篇：植物育种学实习报告

植物育种学实习报告

一：实习目的：通过实习理解和掌握作物育种学基础理论知识，熟练操作玉米、棉花、花生等常见作物杂交育种的基本技能。为以后能够理论联系运用到实际生产中打下坚实基础。

二：实习地点：青岛农业大学农学与植保学院试验田

山东省莱州市登海登海种业股份有限公司

三：实习时间：棉花有性杂交技术 8月31日

花生有性杂交技术 9月2日

玉米有性杂交技术 9月7日

登海种业参观9月18日

四：实习内容：

（一）棉花杂交技术

1.花器构造

棉花的花为两性完全花，单生。花的构造有以下特点：①雄蕊的花丝基部联合成管状，称雄蕊管，与花冠基部相连接，套在花柱下部 ②苞叶内外及花萼内侧，陆地棉与海岛棉均有蜜腺，中棉与草棉没有。

2.杂交的一般步骤

2.1选株

选择性状典型、纯度高、生长良好的棉株作为母本株，在母本株上，选择中部果枝上靠近主秆第一、二节位的正常花作为杂交花朵。

2.2去雄

(1)去雄时间。适宜的去雄时间是开花前1天的下午3点左右。判断花朵次日开放的标志是花冠已经长大，已经伸出于副萼之外。这样的花，第二天早晨即可开放。

(2)去雄方法。棉花去雄常用的方法有徒手去雄和工具去雄两种。

①徒手去雄。是用手将花冠和雄蕊管一起撕去，只保留雌蕊。操作时不要碰伤子房和压破花药。去雄后用顶端带节的3厘米长的麦管套住柱头，一直压到子房上端，但麦管上端有节的部分须离开柱头1厘米以上。套好麦管后，挂上纸牌

（或塑料牌），纸牌上写明母本名称和去雄时间。

②工具去雄。是用剪刀剪去花冠，再用镊子除去花药。如有残留花粉，可用清水洗净。去雄后用麦管套好柱头。并挂好纸牌（或塑料牌）。

2.3授粉

选择与母本花朵同时开花的父本花蕾，在开花前1天用纸袋将花蕾套好，以防止昆虫进入花内，带进其它花粉。第二天上午9～10时，将父本花朵摘下，将花瓣向外翻卷，在此同时，摘下母本花中柱头上的麦管，用父本雄蕊在母本柱头上轻轻涂抹几下，完成授粉工作。涂抹时，量要多些，以利受精。然后，再用麦管套好柱头。

2.4挂牌

在牌上写明父本名称、授粉日期和操作者姓名。

（二）花生杂交技术

1种植亲本因为花生植株矮，开花部位低，花器官结构复杂。去雄和授粉都比较困难，所以大多采用高台池栽，池高大约在80cm左右，池宽以种植两行母本为宜。这样，去雄授粉都可以坐在板凳上进行，既可以减轻杂交过程的劳动强度。又可以提高杂交成功率。杂交的一般步骤

2.1去雄一般是在母本始花后几天开始去雄杂交去雄时间，一般是每天16：00以后。选用花萼微裂。显露出黄色花瓣的花蕾，即第2天早上能正常开放的花。用左手的拇指和中指捏住花蕾的基部，右手持镊子轻轻将花萼、旗瓣、翼瓣拨开，再用左手的食指和拇指压住已拨开的花瓣，然后用镊子轻压龙骨瓣的弯背处，使花蕊露出，用镊子一次或多次将8个雄蕊的花药摘除去净，不要损伤雌蕊的柱头，再用手指将龙骨瓣推回原来位置。使旗瓣、翼瓣恢复原状。

2.2授粉第2天早5：00-9：00对去雄的花朵进行人工授粉。授粉前。按组合先采集一定数量的父本花，然后，用镊子将父本花的花粉挤出放入用酒精消过毒的玻璃培养皿或左手手背上混合均匀，授粉时，用左手食指和中指托住去过雄的花朵，右手拇指或用镊子轻轻挤压龙骨瓣，使雌蕊柱头露出，再用镊子尖端蘸取花粉涂在柱头上，并随即将龙骨瓣复原，包住柱头，也可以采用父本的花朵直接授粉。

（三）玉米杂交技术

1.花器构造开花习性：

雌雄同株异花。雄穗由植株的顶端生长锥分化而成，为圆锥状花序，由主轴和侧枝组成。雌穗一般由从上向下的第6—7节的腋芽发育而成，为肉状花序。玉米雄穗一般抽出后1—3天左右便开花散粉。每天7—11时开花。以9—10时开花最盛，开花顺序是先主轴后侧枝，主轴由中上部开始向上向下依次开放；侧枝则由上而下开放，始花后3—5天为盛花期，一株雄穗花期约7—10天。一个雄穗大约可产生1500—3000万个花粉粒。

2.杂交的一般步骤：

2.1选株：当雌穗膨大从叶腋中露出尚未吐丝时，选择具有亲本典型性状健壮无病虫害的优良单株。

2.2雌穗套袋：先将雌穗苞叶顶端剪去2—3cm，然后用硫酸纸袋套上雌穗，用回形针将袋口夹牢。

2.3剪花丝：如套袋的雌穗已有花丝伸出，则在下午取下雌穗上所套的纸袋，用经酒精擦过的剪刀将雌穗已吐出的花丝剪齐，留下长约2cm，再套回纸袋，待第2 天上午授粉。

2.4雄穗套袋：在剪花丝的当天下午，用大硫酸纸袋将同株的雄穗套住，并使雄穗在纸袋内自然平展，然后将袋口对称折叠，用回形针卡穗轴基部固定。

2.5授粉 ：雄穗套袋后的第2 天上午，在露水干后的盛花期进行

2.6挂牌登记：授粉后在果穗所在节位挂上塑料牌，用铅笔注明材料代号或名称、自交符号、授粉日期和操作者姓名，并在工作本上作好记录。

（四）登海登海种业股份有限公司实习

9月18日我们去了在登海登海种业股份有限公司实习，给我印象最深的就是他们对超级玉米的研究，超级玉米选育是登海种业主持的十一五国家科技支撑计划重点项目，登海种业通过种质资源的自主创新和多年艰苦努力，在我国率先育出了超级玉米新品种。这类超级玉米具有根系发达、穗位低、抗倒伏的特点，并具有1100公斤以上的高产能力和1000公斤以上的稳产能力。据初步试验试种，比全国对照品种郑单958增产5-27%以上。他们经过36年的不懈努力培育了一系列品种，并数次打破全国高产纪录，他们这种坚持不懈努力进取的精神是值得

我们终身受用。（登海几个新超试品种介绍见附录）

五：实习总结

在实习中我们通过理论与实际的结合、学校与社会的沟通，进一步提高了我们的思想觉悟、专业水平，尤其是观察、分析和解决问题的实际工作能力，为今后在社会中找到自己的位置，体现出自我的价值,打下了坚实的基础，同时也完成了自己的观念与目光从学校到社会的过渡与转换。实习充实了我们的专业理论知识，把我们课堂上学到的系统化的理论知识，全面地应用于实际科研工作，并从理论的高度对科研工作有更多，更广，更深刻的了解。实习也帮我们检验了在学校的理论知识学习成果，让我们在以后的学习期间及时补充相关知识，为求职与正式工作做好充分的知识、能力准备，从而尽快适应岗位的要求，达到更高的目标。

最后在这里，我们由衷的感谢登海种业股份有限公司和我们的史新海老师给我们提供了这次意义重大而深远的自我锻炼机会，让我们能更好的学习和实践。

第五篇：基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用

基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用

基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用

摘要：

目的：药用植物遗传背景基础资料缺乏，对其次生代谢途径及其调控机制的认识不够深入，阻碍了细胞或组织培养、代谢工程等在获取高价值次生代谢物上的广泛应用。功能基因组学方法，尤其cDNA-AFLP 转录轮廓分析和代谢组学的整合运用，将次生代谢物的变化与相关基因的表达相关联，在挖掘次生代谢物生物合成相关基因、探索次生代谢途径方面展现出广阔的应用前景，是植物次生代谢物研究的新趋势和重要手段之一，将有力地促进药用植物资源更好的开发利用。植物在长期进化过程中与环境相互作用，产生大量不同种类的小分子有机化合物——次生代谢物(secondarymetabolites)。

【关键词】 次生代谢物；功能基因组学；转录组学；代谢组学；代谢工程

植物在长期进化过程中与环境相互作用，产生大量不同种类的小分子有机化合物——次生代谢物(secondary metabolites)。次生代谢物在植物适应特殊生态环境、对抗生物或非生物压力等方面发挥着重要作用，如抵御病虫害、适应生态环境变化、诱导授粉或防紫外线灼伤等[1-2]。很多次生代谢物化学结构复杂而独特，具有特殊的生物活性，是药用植物的主要活性成分[3]。药用植物在药物研发中应用广泛，是传统中药主要来源，其次生代谢物是新药、新先导化合物(drug leads)、新化学实体(new chemical entities，NCEs)的重要来源[4-5]。

从生物合成的起源来看，药用植物次生代谢物可分为5大类：多聚酮类(polyketides)、异戊二烯类(isoprenoids)、生物碱类(alkaloids)、苯丙烷类(phenyl propanoids)、黄酮类(flavonoids)。多聚酮类由乙酸-丙二酸途径(acetate-malonate pathway)产生；异戊二烯类（包括萜类和固醇类）由五碳前体异戊烯焦磷酸(isopenteny l diphosphate，IPP）经过经典的甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway，MVA pathway)或MEP 代谢途径(methyl-erythritol phosphate pathway)产生；生物碱类由不同种类的氨基酸合成；苯丙烷类含有1 个C6-C3单元，起源于芳香氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸；黄酮类由苯丙烷类与多聚酮类相结合的途径合成[6]。不同种类的药用植物次生代谢物在药物开发中均有应用[7]。然而，来源于药用植物的次生代谢物往往含量低，且天然药用植物资源有限，增加了药物开发的难度[7]。药用植物次生代谢产物的生物合成往往包含多个步骤，过程长而复杂，有多种酶参与，至今仍有很多问题悬而未决。目前，药用植物中仅有少数次生代谢途径（如黄酮类，吲哚三萜，异喹啉生物碱）经过多年经典生物化学研究已有较深入的认识[8-9]，而大部分次生代谢途径还有待进一步阐明，阻碍了生物技术生产次生代谢物的成功应用。功能基因组学方法是全面探索生系统的有力工具，是发现次生代谢物生物合成相关基因及阐明次生代谢途径的有效手段[10]，将成为药用植物次生代谢物研究以及中药现代化研究的发展趋势之一[11-12]。

一、药用植物次生代谢物的获得途径

总的来说，药用植物次生代谢物的获得途径有①从植物（包括野生和栽培植物）中提取分离；②对结构已知的次生代谢物寻求化学合成或结构改造；③从植物细胞或组织培养物中获得；④代谢工程生产。目前，从植物中提取分离仍是获得次生代谢物最主要的途径，而且其中大约2/3 来源于野生资源[13]。然而，大多数次生代谢物在植物中含量低，且只在特殊组织部位、特定生长阶段或生长环境下积累，过度依赖野生资源会危及濒危物种、破坏环境。药用植物栽培在一定程度上可以缓解这些问题，但由于生长环境要求高、耗时长、劳动量大等原因，使得药用植物栽培成本较高、难度较大[14]。大部分次生代谢物结构复杂，常含有特异的立体化学结构(stereochemistry)，使得化学全合成往往不可能或者经济上不可行。

在基于次生代谢物作用机制知识的基础上合成作用相似的替代物，或者对次生代谢物进行结构修饰，是药物开发中一种经济可行的策略。例如，以薯蓣皂苷元(diosgenin)为基本骨架，经化学修饰开发出大量类固醇激素类药物。作为获得药物植物次生代谢物一种可能的替代方法，运用细胞或组织培养物产生有商业价值的次生代谢物的研究已广泛开展。虽然许多不同种类的药用植物细胞或组织培养体系已经被确定，但它们常常并不能产生足够量的目标次生代谢物[15]。可能的原因如下：次生代谢物细胞内毒性高，导致其在培养物中往往并不积累或者含量很低[16]；培养物容易受后天变化(epigenetic changes)的影响，产物水平不稳定，使得依靠经验摸索选择高产、稳定的培养体系难度较大。通过筛选选择高产率细胞系、优化培养基、加入茉莉酸甲酯等诱导因子、运用毛状根培养等方法能够在一定程度上提高目标次生代谢物产量[17]。

成功的例子有： 运用紫草Lithospermum erythrorhizon 细胞悬浮培养生产紫草素(shikonin)；从罂粟Apaver somniferum 细胞培养生产血根碱(sanguinarine)等。但由于产量以及生产成本等问题，目前这种方法商业成功率仍然非常有限。代谢工程为产生目标次生代谢物、提高其含量提供了新的前景。调控次生代谢途径要求彻底认识其整个生物合成途径，详细了解代谢途径中控制启动和流通的调控机制。目前，这种方法已经被成功的运用于微生物生产本体或异源次生代谢物[18]。例如，在大肠杆菌Escherichia coli 中生产抗疟疾成分青蒿素的前体青蒿酸(amorphadiene)[19]。然而，药用植物与微生物不同，通常次生代谢途径更长，酶催化步骤更多，因此阻碍了代谢工程在药用植物中的应用。功能基因组学研究将最终揭示次生代谢物的生物合成途径，为药用植物代谢工程以及细胞或组织培养与代谢工程相结合的途径产生次生代谢物奠定坚实的理论基础。

二、功能基因组学的基本研究工具

拟南芥、水稻全基因组测序完成，其他几种植物如杨、苜蓿、莲、土豆、玉米等序列信息的发现[20-22]，有力推进了基因组学的发展。然而，仅仅依靠大量序列信息，许多基因的功能无法阐明。通过改变单个因素或基因探索基因功能的方法效率较低、成本较高，这要求大规模分析基因功能[23]，从而催生了功能基因组学。功能基因组学(functional genomics)应用多重平行的方法，包括转录组学(transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)、代谢组学(metabolomics)，采用高通量模式在基因组或系统水平上全面研究分析基因功能，是全面探索生物系统的有力工具，最终将建立起基因组(genome)和表型组(phenome)之间的联系[10,24]。

转录组学在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律，其发展使得全面系统研究基因表达、发现新基因、诠释基因功能成为可能。常用的转录轮廓分析方法有：差异性显示(differential display)，cDNA 微阵列（cDNA microarray），基因芯片(gene chip)，表达序列标签(expressions equence tags，EST)分析，基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression，SAGE)，大规模平行测序技术(massively parallel signature sequencing，MPSS)，cDNA-扩增片段长度多态性（cDNA-amplified fragment lengt polymorphism，cDNA-AFLP）等[22,25-26]。cDNA-AFLP 是Bachem 等1996 年在AFLP(amplified fragment length polymorphism)的基础上发明出来的一项RNA 指纹图谱技术，基本原理是对cDNA 限制性酶切片段进行选择性扩增，通过扩增片段获得基因表达信息[27]。cDNA-AFLP 与基于杂交的转录图谱技术cDNA 微阵列和基因芯片相比，最显著的优点为不需要事先知道基因组序列信息、灵敏度高、特异性高、重复性好、启动成本相对较低，在基因表达研究方面可有效替代后两者[28]。cDNA-AFLP 已逐渐成为探索基因序列信息相对缺乏的药用植物基因表达的有力工具[29-30]，主要应用于定量基因表达分析，新基因发现，表达数量性状基因坐(quantitative trait loci，QTL)作图等方面，适用于任何物种[25]。

蛋白质组学在大规模研究基因表达、揭示蛋白质功能、探索酶的催化调控作用等领域发挥着举足轻重的作用，主要的分离分析方法有：二维凝胶电泳(two dimensional gelelect rophoresis)，质谱技术，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI/TOF MS)、电喷雾离子化质谱(electro spraying ionization-mass spectrometry，ESI-MS)等。二维凝胶电泳技术是高效分离分析多种蛋白的主要手段。质谱技术灵敏度、特异性高，主要应用于精确鉴定蛋白质[31]。由于蛋白质自身结构复杂、特异，且存在相互作用，蛋白质组的研究常需要结合二维凝胶电泳、质谱技术以及用于研究蛋白质相互作用的分析技术，如酵母双杂交技术、蛋白质芯片[32]。

代谢组学的形成和发展使得对于代谢网络的整体动态变化的衡量成为可能或者更接近于真实，尤其适合于特定条件下的代谢表型(metabolic phenotypes)的研究[33-34]，并且迅速成为阐释基因功能、全面了解细胞对生物环境反应的关键工具[35]，也是药用植物、中医药现代化研究非常重要的手段[36-37]。

常用的分析方法有：核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、气相色谱-质谱联用(gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS)、液相色谱-质谱联用(liquid chromatography coupled with mass spectrometry，LC-MS)、傅立叶质谱(Fourier transform mass spectrometry，FTMS)和毛细管电泳-质谱联用(capillary electrophoresis coupled with mass spectrometry，CE-MS)等[38]。近年来又发展出了串连质谱、液相色谱与核磁共振联用等新技术。这些分析方法各有优缺点，NMR 快速、选择性好、代谢物结构鉴定方便，但灵敏度相对较低、检测动态范围窄；基于分离和质谱联用的技术灵敏度高、专属性好，但样品前处理及分析需要相对较长的时间。选择合适的分析技术需要综合考虑代谢物谱的特征，分析速度、选择性和灵敏度[39-40]。

三、药用植物功能基因的挖掘

对于药用植物来说，由于基因组序列信息及其相关数据库、功能基因组学研究工具的缺乏，其次生代谢物相关基因的全面研究几乎未见报道。整合转录组学与代谢组学的功能基因组学方法是该研究领域的一个突破口[6]（图1）。使用茉莉酸甲酯(methyljasmonae，MeJA)、水杨酸(salicylic acid，SA)、壳聚糖(chitosan)或重金属(heavy metals)等刺激因子处理未分化的细胞通常能够提高次生代谢物产量[11-12]。

假设目标次生代谢物的含量提高的同时，与这些成分生物合成相关的基因也被激活，那么，在药用植物细胞或组织培养物中，当目标次生代谢物诱导条件确定后，基因组层面的转录轮廓分析就能够确定与之累积相关的基因表达，筛选出与次生代谢相关的基因进行功能分析，阐明和验证它们的功能，进而应用于提高次生代谢物产量。理论上，这种方法适用于任何药用植物细胞或组织培养物。

图1 一种用于提高植物细胞中次生代谢物

含量的功能基因组学方法概要：Alain Goossens[43]等运用cDNA-AFLP 的转录轮廓和目标代谢物轮廓分析相结合的方法分析了茉莉酸甲酯诱导后的烟草细胞培养物，在2 万个可见基因片段中，确定591个由茉莉酸甲酯诱导转录，同源搜索显示，其中58％的基因片段功能已知，几乎包括所有和尼古丁生物合成相关的基因，如编码鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、喹啉酸磷酸核糖基转移酶的基因和许多据推测可能在生物碱合成中起作用基因；约15％的基因编码功能不确定的蛋白以及信号转导蛋白，如受体、激酶、磷酸酶和转录因子，这些蛋白的诱导与尼古丁生物合成相关基因的上调一致。Heiko Rischer[44]等运用cDNA-AFLP 转录轮廓分析和代谢轮廓分析相结合的方法，分析茉莉酸甲酯诱导的长春花细胞培养物，得到一系列已知或未知的基因标签以及与二萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids，TIAs)相关的代谢物；通过搜索417 个差异性表达基因标签和178 个代谢峰的累积轮廓之间的关联，他们首次描画了从基因到基因(gene-to-gene)以及从基因到代谢(gene-to-metabolite)的网络，这些代谢网络揭示了二萜类吲哚生物碱具有不同的代谢分支，且不同的代谢途径受到不同的植物激素调节，也揭示了与二萜类吲哚生物碱生物合成相关的一系列基因和代谢物。整合转录组学和代谢组学，构建从基因到代谢的网络，将促进包含多种层面（包括基因表达、酶活性和代谢物水平）、相互作用的生物体系之间的信息的整合，发现关键调节成分从而阐明基因功能，进一步确定与药用植物次生代谢物生物合成、转运、调节、修饰相关的新基因及其调控机制[45]。

四、药用植物次生代谢工程

代谢工程通过调控与代谢途径相关的基因、关键酶、代谢通路、代谢物等途径，改变目标次生代谢物含量。功能基因组学研究领域的基本问题是确定与次生代谢物生物合成相关的各个因素，包括基因表达、酶及其调节水平，其研究成果为代谢工程产生次生代谢物提供了理论基石，目前已经有较多应用。

引入或过量表达编码关键酶如限速酶的基因能够调控代谢途径。Dae-Jin Yun[46]等的研究表明，在颠茄Atropa belladonna中引入编码莨菪碱-6β-羟化酶(hyoscyamine-6β-hydroxylase)的基因，导致了颠茄中含量很低的高价值托品生物碱东莨菪碱(scopolamine)的累积，几乎所有的莨菪碱都转化成了东莨菪碱。该基因在黑莨菪Hyoscyamus muticus 毛状根中过量表达效果更剧烈，不仅产生了大量的东莨菪碱，而且累积了高含量的莨菪碱[47]。Lee[48]等研究表明，在人参中过量表达角鲨烯合成酶基因(squalene synthase gene)获得了更高含量的三萜(triterpenes)和植物甾醇(phytosterols)。使某个基因沉默导致代谢途径中产生或阻断代谢支路也能使某种代谢物累积。

Allen [49]等的研究已经表明，阻断罂粟中产生吗啡的代谢途径，会导致荔枝碱(reticuline)及其甲酯的积累。在咖啡植物中，调控咖啡因的相关代谢通路可控制其含量[50]。转录因子(transcriptional factors)异常表达启动整个代谢途径的能力显示了调控次生代谢途径新的可能性。长春花二萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids，TIAs)生物合成途径的主导调节子基因Orca3，该基因编码产物ORCA3含有一个AP2/ERF 功能域，为茉莉酸应答性调节子(jasmonate-responsive regulator)。在长春花细胞培养物中，连续产生过量ORCA3导致几种与二萜类吲哚生物碱生物合成相关基因的过量表达以及二萜类吲哚生物碱累积[51]。在细胞或组织培养物中，次生代谢物常储存在植物液泡内，转运器(transporter)很可能在次生代谢物转运区隔中发挥着重要作用。次生代谢物的细胞毒性限制了其在细胞中累积。尼古丁和其他生物碱对植物细胞毒性高，在转基因土豆细胞中过量表达酵母ABC 转运器(ABC transporter)PDR5 被证实能减小尼古丁的细胞毒性，增加其累积[52]。

功能基因组学的发展为产生或设计新的次生代谢物提供了前所未有的机会，运用代谢工程以及植物细胞或组织培养物与代谢工程相结合的方法产生次生代谢物将会取得更大的突破。

五、展望

由于药用植物缺乏大量序列数据信息，使得基因表达的系统分析、微阵列等转录轮廓分析方法难以应用，严重阻碍了大规模的基因发掘。相比而言，由于不需要事先知道基因组序列信息，cDNA-AFLP 分子标记技术成为目前广泛发掘药用植物基因以及定量分析基因表达谱的有力工具。代谢组学的兴起使得大规模定量检测整体或目标代谢物成为可能。

作为对基因表达活动的响应，次生代谢物更为灵敏地反映了基因表达与调控的变化，基于cDNA-AFLP 的转录轮廓分析与代谢组学整合，能够将基因表达变化与代谢物变化相关联，并通过次生代谢物的变化规律发现新基因、推测代谢途径、阐释基因功能，在次生代谢物生物合成途径及相关基因功能阐明研究中已显现出广阔的应用前景。

随着技术的发展及研究的深入，基因组、基因表达数据库的不断扩充和完善，更多的功能基因组学研究工具，包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学及其全面深入的整合[45]，将越来越广泛地应用于药用植物及中医药研究领域。这种整体系统方法和传统还原分析方向相结合，必将加速揭示药用植物基因的功能，建立起基因表达水平、酶活性和次生代谢物之间的因果关联，最终阐明次生代谢途径及其相关基因的表达调控机制。

这些研究成果将促进细胞或组织培养基因工程、代谢工程产生高价值活性成分的应用，有力推进药用植物次生代谢物的开发和中药材新品种培育，在保护自然资源、保持生物多样性的同时使人类极大受益[53-54]。

[参考文献] [1] Dixon R A.Natural products and plant disease resistance[J].Nature，202_，411(6839)：843.[2] Wink M，Schimmer O.Functions of plant secondary metabolites andtheir exploitation in biotechnology[M].Sheffield ： Sheffield Academic Press，1999：17.[3] Itokawa H，Morris-Natschke S L，Lee K H，et al.Plant-derived natural product research aimed at new drug discovery[J].J Nat Med，202_，62(3)：263.[4] Butler M S.The role of natural product chemistry in drug discovery [J].J Nat Prod，202_，67(12)：2141.[5] Newman D J，Cragg G M，Snader K M.Natural products as sources of new drugs over the period 1981-202_ [J].J Nat Prod，202_，66(7)：1022.[6] Oksman-Caldentey K M，Inze D.Plant cell factories in the post-genomic era ： New ways to produce designer secondary metabolites [J].Trends Plant Sci，202_，9(9)：433.[7] Balunas M J，A D Kinghorn.Drug discovery from medicinal plants[J].Life Sci，202_，78(5)：431.[8] Dixon R A，Steele C L.Flavonoids and isoflavonoids-A gold mine for metabolic engineering[J].Trends Plant Sci，1999，4(10)：394.[9] Hashimoto T，Yamada Y.New genes in alkaloid metabolism and transport[J].Curr Opin Biotech，202_，14(2)：163.[10] Colebatch G，Trevaskis B，Udvardi M.Functional genomics：tools of the trade[J].New Phytol，202_，153(1)：27.[11] 陈晓亚.植物次生代谢研究[J].世界科技研究与发展，202_，28(5)[12] 王永炎.中医药研究中系统论与还原论的关联关系[J].世界科学技术——中医药现代化，202_，9(1)：70.[13] Edwards R.No remedy in sight for herbal ransack[J].New Sci，202_，181(2429)：10.[14] Wu Jianyong，Zhong Jianjiang.Production of ginseng and its bioactive components in plant cell culture：Current technological and applied aspects[J].J Biotechnol.1999，68(2/3)：89.[15] Ramachandra R S，Ravishankar G A.Plant cell cultures：Chemical factories of secondary metabolites[J].Biotechnol Adv，202_，20(2)： [16] Vanisree M，Lee C Y，Tsay H S，et al.Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures [J].Bot Bull Acad Sinica，202_，45(1)：1.[17] Verpoorte R A，Contin，Memelink J.Biotechnology for the production of plant secondary metabolites[J].Phytochem Rev，202_，[18] Mijts B N，Schmidt-Dannert C.Engineering of secondary metabolite pathways[J].Curr Opin Biotech，202_，14(6)：597.[19] Martin V J J，Pitera D J，Keasling J D，et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids[J].Nat Biotechnol，202_，21(7)[20] Kaul S，Koo H L，Jenkins J，et al.Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana[J].Nature，202_，408(6814)：796.[21] Sasaki T.The map-based sequence of the rice genome [J].Nature，202_，436(7052)：793.[22] Rensink W A，Buell C R.Microarray expression profiling resources for plant genomics[J].Trends Plant Sci，202_，10(12)：603.[23] Jansen R C.Studying complex biological systems using multifactorial perturbation[J].Nat Rev Genet，202_，4：145.[24] Vij S，Tyagi A K.Emerging trends in the functional genomics of the abiotic stress response in crop plants ：Review article[J].Plant Biotechnol J，202_，5(3)：361.[25] Marnik V，Johan D P，Michiel J T van Eijk.AFLP-based transcript profiling(cDNA-AFLP)for genome-wide expression analysis[J].Nat Protoc，202_，2(6)：1399.[26] Busch W，Lohmann J U.Profiling a plant：Expression analysis in Arabidopsis [J].Curr Opin Plant Biol，202_，10(2)：136.[27] Bachem C W B，Visser R G F，R S van der Hoeven，et al.Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP：Analysis of gene expression during potato tuber development[J].Plant J，1996，9(5)：745.[28] Reijans M，Lascaris R，Groeneger A O，et al.Quantitative comparison of cDNA-AFLP，microarrays，and genechip expression data in Saccharomyces cerevisiae[J].Genomics，202_，82(6)：606.[29] Breyne P，Dreesen R，Vandepoele K et al.Transcriptome analysis during cell pision in plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，202_，99(23)：14825.[30] Sarosh B R，Meijer J.Transcriptional profiling by cDNA-AFLP reveals novel insights during methyl jasmonate，wounding and insect attack in Brassica napus[J].Plant Mol Biol，202_，64(4)：425.[31] Beranova G S.Proteome analysis by two-dimensional gelelectrophoresis and mass spectrometry：Strengths and limitations[J].Trac-Trend Anal Chem，202_，22(5)：273.[32] Chen S，Harmon A C.Advances in plant proteomics[J].Proteomics，202_，6(20)：5504.[33] Fiehn O.Metabolomics ——The link between genotypes and phenotypes[J].Plant Mol Biol，202_，48(1/2)：155.[34] Villas-Boas S G，Rasmussen S，Lane G A.Metabolomics or metabolite profiles?[J].Trends Biotechnol，202_，23(8)：385.[35] Schauer N，Fernie A R.Plant metabolomics：Towards biological function and mechanism[J].Trends Plant Sci，202_，11(10)：508.[36] 贾 伟，蒋 健，刘平，等.代谢组学在中医药复杂理论体系研究中的应用[J].中国中药杂志，202_，31(8)：621.[37] 齐炼文，李 萍，赵 静.代谢组学与中医药现代研究[J].世界科学技术——中医药现代化，202_，8(6)：79.[38] Sumner L W，Mendes P，Dixon R A.Plant metabolomics：Large-scale phytochemistry in the functional genomics era[J].Phytochemistry，202_，62(6)：817.[39] Dettmer K，Aronov P A，Hammock B D.Mass spectrometry-based metabolomics [J].Mass Spectrom Rev，202_，26(1)：51.[40] Dunn W B，D I Ellis.Metabolomics：Current analytical platforms and methodologies[J].Trac-Trend Anal Chem，202_，24(4)：285.[41] Poulev A，Neal J M O，Logendra S，et al.Elicitation，a new window into plant chemopersity and phytochemical drug discovery[J].J Med Chem，202_，46(12)：2542.[42] Zhao J，Davis L C，Verpoorte R.Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites[J].Biotechnol Adv，202_，23(4)：283.[43] Goossens A，Hakkinen S T，Laakso I，et al.A functional genomics approach toward the understanding of secondary metabolism in plant cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，202_，100(14)：8595.[44] Rischer H，Orešič M，Seppänen-Laakso T，et al.Gene-to-metabolite networks for terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，202_，103(14)：5614.[45] Yuan J S，Galbraith D W，Dai S Y，et al.Plant systems biology comesof age[J].Trends Plant Sci，202_.13(4)：165.[46] Yun D J，Hashimoto T，Yamada Y.Metabolic engineering of medicinal plants：Transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(24)：11799.[47] Jouhikainen K，Lindgren L，Jokelainen T，et al.Enhancement of scopolamine production in Hyoscyamus muticus L.hairy root cultures by genetic engineering[J].Planta，1999，208(4)：545.[48] Lee M H，Jeong J H，Seo J W，et al.Enhanced triterpene and phytosterol biosynthesis in Panax ginseng overexpressing squalene synthase gene[J].Plant Cell Physiol，202_，45(8)：976.[49] Allen R S，Millgate A G，Chitty J A，et al.RNAi-mediated replacement of morphine with the nonnarcotic alkaloid reticuline in opium poppy[J].Nat Biotechnol，202_，22(12)：1559.[50] Ogita S，Uefuji H，Yamaguchi Y，et al.Producing decaffeinated coffee plants[J].Nature，202_，423(6942)：823.[51] Van Der Fits L，Memelink J.ORCA3，a jasmonate-responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism[J].Science，202_，289(5477)：295.[52] Goossens A，Hakkinen S T，Laakso I，et al.Secretion of secondary metabolites by ATP-binding cassette transporters in plant cell suspension cultures[J].Plant Physiol，202_，131(3)：1161.[53] 刘昌孝.代谢组学与医药科学研究[J].中国医学科学院学报，202_，29(6)：712.[54] 陈 竺.系统生物学——21 世纪医学和生物学发展的核心驱动力[J].世界科学，202_，5：3.