第一篇：沙门菌检测技术

沙门菌为常见的肠道病原菌之一，在自然界分布广泛，种类繁多，所致疾病统称沙门菌感染，其中由伤寒、副伤寒沙门菌引起的急性全身系统性传染病是我国《传染病防治法》中规定报告的乙类传染病，而由非伤寒沙门菌引起的食物中毒则占我国内陆地区细菌性食物中毒的首位。

及时准确地检验沙门菌，为诊断和控制由该菌引起的疾病提供依据。沙门菌检验程序主要包括：标本采集、标本的处理与接种、菌株分离与鉴定和PCR检测几个步骤。

标本采集

标本采集前，应准备好所需的培养基和器材，主要有：血液需氧培养瓶、血琼脂平板、XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐）琼脂平板、BS（亚硫酸铋）琼脂平板、SC（亚硒酸盐胱氨酸）增菌液、酒精灯、采样瓶、剪刀、镊子等。

沙门菌检验标本主要分为：食品样品、可疑食物中毒标本，沙门菌患者标本。可疑食物中毒标本主要有：可疑食品、相关环境标本、疑似病人标本。可疑食品的采集：在采集可疑食物中毒标本时，应重点采集剩余食物以及食品加工有关的炊事用具，操作人员的手、肛试等相关环境标本。采样时，用棉试子涂抹物品表面后，置于少量增菌培养基内，也可根据情况在接种现场接种分离平板。

沙门菌感染患者标本的采集：沙门菌感染患者应采集新鲜粪便标本或肛试子直接接种分离平板和增菌液。对伤寒、副伤寒患者，在病程的第1~2周，可采集静脉血液4~8ml，接种血液需氧培养瓶中。

每个标本需做好标识和记录，采集的食品样品4℃保存，已接种标本的增菌液和培养基，室温下保存，2小时内送达实验室。

标本的处理与接种

沙门菌标本的处理与接种常用培养基有：TTB（四硫磺酸钠）增菌液、SC(亚硒酸盐胱氨酸)增菌液、XLD琼脂平板、BS琼脂平板和麦康凯（MaC）琼脂平板。

可疑中毒食品标本的处理：对采集的标本通常按1:10的比例分别接种于100mlTTB和100ml增菌液中，每瓶增菌液加入标本约10g，同时还可将可疑中毒食品标本直接接种于分离平板。将接种后的TTB增菌液置42℃培养箱中培养18~24小时，将SC增菌液和分离平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。取培养后增菌液转种XLD琼脂平板和BS琼脂平板，将接种后的平板置37℃培养箱中培养24~48小时，待观察。

血液（骨髓）标本的处理：将已接种标本的血液培养瓶直接放置37℃培养箱中培养7天，在培养期间分别于培养的第1天、第2天和第7天取培养液一环接种血琼脂平板，将平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。培养至第7天时，如培养物仍无菌生长，则可判为阴性。

肛试子及其他环境标本的处理：将现场采集已接种标本的分离平板和增菌液直接放置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。取出18~24小时培养的增菌液转种XLD琼脂平板和麦康凯琼脂平板。将接种完毕的平板置37℃培养箱中培养18~24小时，待观察。

菌株分离与鉴定

主要实验试剂有：氧化酶（试剂）、三糖铁（TSI）、动力—靛基质—尿素半固体（MIU）和赖氨酸铁琼脂斜面、API20E、沙门菌诊断血清。

沙门菌菌株的鉴定主要试验有：菌体形态观察，菌落形态观察，氧化酶实验，初步生化鉴定（系统生化鉴定），血清学分型。

菌落形态观察：在XLD平板上沙门菌菌落呈粉红色、光滑、湿润、边缘整齐、产H2S的菌株，可形成中心黑色或全部黑色的菌落。在BS琼脂平板上，沙门菌菌落呈黑色有金属光泽、棕色或灰色，培养基周围可呈现黑色或棕色，有些菌株可形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。在麦康凯琼脂平板上，沙门菌菌落为无色、透明或半透明、光滑湿润、边缘整齐、圆形。从分离平板上挑取3-5个可以菌落，分别接种XLD平板和营养琼脂平板，将接种完毕的平板置37℃培养箱中，18~24小时纯化培养。

菌体形态观察：挑取纯培养物进行革兰染色，在显微镜下观察菌体形态。沙门菌为革兰阴性杆菌，长1-3um，宽0.5~1um，无芽胞，两端钝圆。

氧化酶试验：用一次性接种环（或牙签）挑取菌落于滤纸上，滴加氧化酶试剂一滴，在10s内菌落不变色为阴性，呈现紫色者为阳性。本试验菌落不变色，氧化酶试验为阴性：

初步生化鉴定：将菌落形态和氧化酶试验符合沙门菌特征的纯培养物分别接种于三糖铁琼脂斜面（TSI）、MIU培养基、赖氨酸铁琼脂斜面，将已接种的生化培养基置37℃培养箱中，培养18~24小时，待观察。

典型的沙门菌在三糖铁（TSI）上，斜面呈红色，下层产酸呈黄色，多数沙门菌产生硫化氢，试管内出现黑色，有气泡。

赖氨酸脱羧酶试验阳性，培养基由紫色变成紫黑色。

在MIU培养基上尿素为阴性培养基不变色，有动力，沿穿刺线浑浊生长，加入靛基质试剂0.5ml于试管内，轻摇试管，沙门菌靛基质试验结果不定。本试验靛基质试验为阴性，试剂不变色。

系统生化鉴定：肠杆菌科细菌在生化反应上有类似之处，对初步生化试验符合沙门菌的可疑菌株需要进一步做系统的生化鉴定。生化试剂可采用自配或市售成品，也可选用生化鉴定试剂盒（API 20E）或全自动微生物鉴定系统（VITEK）。本试验以API 20E生化鉴定试剂盒进行示范，具体操作步骤如下：

菌悬液制备：挑取24小时培养的营养琼脂平板上1~2个菌落至5ml灭菌生理盐水中制成均匀的菌悬液。

接种与培养：将配制好的菌悬液按产品说明书要求填充API 20E条上的小杯，按要求加盖矿物油，置于36℃培养箱中培养18~24小时，待观察。

结果观察与判定：按照说明书要求，在读取结果前，部分试验先添加附加试剂。根据API 20E中的读数表判定和记录各项反应结果，并得到一个7位数的编码，通过在数据库或API编码表中查询该编码即可获得菌株鉴定结果。

血清学分型：对生化鉴定为沙门菌的菌株，需用玻片凝集法进行血清学分型，血清学分型试验的主要步骤为：先用A-F多价血清作玻片凝集，若血清发生凝集再分别选用O4 O9 O2 O10 O7等因子血清做玻片凝集，以判定其群别。根据判定的O抗原，进行H抗原的第一相和第二相抗原凝集和判定，下面以某品牌血清为例进行试验。

第一步，O抗原凝集，分别取一环A~F血清和生理盐水于洁净的载玻片上，挑取待检菌株新鲜培养物适量，研成乳状，倾斜摇动玻片1分钟，观察血清凝集情况。若血清产生凝集颗粒盐水无颗粒者判为阳性；两者均无凝集颗粒产生，判为阴性；盐水有颗粒者为粗糙型菌株，不能分型。本菌株结果为阳性。

第二步，取一环O4血清于洁净的载玻片上，用与上述相同的方法试验，结果若为阳性，进行H因子血清凝集试验；若结果为阴性，再分别选用O9 O2 O10 O7等因子血清进行玻片凝集试验。本菌株O4为阳性。

第三步，H抗原凝集，在沙门菌抗原表中，选择与O4相对应的H因子的第一相和第二相单因子血清作逐一凝集试验。本次实验结果被检沙门菌的抗原式为1,4,5，12：i：1,2 为鼠伤寒沙门菌。

血清凝集试验中几种特殊情况：

1.Vi抗原的判定：伤寒或丙型副伤寒沙门菌的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，含丰富Vi抗原的伤寒菌株，经煮沸破坏Vi抗原，再与O血清凝集。实验方法为，取适量菌苔于1ml生理盐水中，在酒精灯火焰上煮沸后再与O血清凝集，若仍不凝集，可送上级单位鉴定。2.位相诱导法试验：如双相菌只检出一相H抗原时，可用位相诱导的方法获得另一相抗原。位相诱导方法较多，主要有，小玻璃管法、小倒管法、简易平板法。本篇着重介绍简易平板法。将0.7%~0.8%半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取已知相因子血清一环滴在半固体琼脂平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央 点接种待检菌株，36℃培养18~24小时后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌做凝集试验。

3.H抗原不凝集：如果两相H抗原均不出现，则应通过半固体琼脂平板、血平板等琼脂平板传代法获得某相或两相抗原

PCR检验

在沙门菌的检测工作中，常利用PCR技术来做沙门菌检测的初筛实验，以提高工作效率，降低成本。PCR初筛试验采用检测样品增菌液中是否有沙门菌属侵袭性抗原保守基因（invA 基因）的存在，以此来判定是否有沙门菌的存在。PCR反应条件，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环72℃延伸7min。

用凝胶成像系统观察结果时，如在284bp处出现扩增条带，则为阳性，凡是PCR检测呈阳性结果的标本，均应进行沙门菌病原菌的检测。

注意事项

在沙门菌检验过程中，应注意以下问题。

1.试验应在BSL-2生物安全实验室的二级生物安全柜中进行操作，并做好个人的安全防护工作。

2.在生化初筛试验中应特别注意，只有在三糖铁琼脂斜面和底层均产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株或尿素酶阳性的菌株可以排除，其他的反应进行进一步的试验确证。

3.沙门菌的鉴定和血清学分型试验必须使用纯化菌株。

4.BS琼脂平板要求的培养观察时间为48小时，此时才能形成描述的典型菌落。

第二篇：检测技术[推荐]

《检测技术》实验时间安排表

第九周星期四上午 8：00-11:20C11-4班前半班20110143--20110163

星期六上午 8：00-11:20C11-4班后半班 20110164---…

第十周星期四上午8:00-9:40

20110143--20110163

星期四上午9:40-11:20

20110164---…

C11-4班前半班C11-4班后半班

第三篇：em菌水蛇养殖技术

水蛇除喜食各种淡水杂鱼、泥鳅外，还尤喜欢黄鳝和各种蛙类。应根据容易捕获的季节或水蛇的育肥特按时投喂，尽量使投饵种类多样化，满足其身体生长的需要。大多数水蛇食欲旺盛，每隔4-5天便要摄食一次。一般条重约100-200克的水蛇，每次可吞食1-2条小杂鱼，多者可达3-4条。水蛇的胆量非常的大，饮食过程中有旁人的打扰也不会影响到它正常饮食。但是在水蛇进食后，就不要在过分的惊扰水蛇了，否则会将吞入腹中的食物吐出来。不仅会延迟下一次的进食时间，还会减少应有的进食量，对水蛇的生长极为不利。饲养水蛇是目前人工养殖蛇类中死亡率最低的品种，只要饲养者采取科学的喂养方法，注重水蛇生长的环境健康，水蛇就能够健康的成长。

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1、池塘养殖，放苗或水花前3-4天每亩用2000ml全池泼洒，放苗或水花时，用1公斤兑水100公斤，浸泡15分钟，每亩泼洒2公斤,以后每隔15-20天喷洒一次，每亩用2公斤泼洒。

2、水库使用，每亩按2-3公斤稀释使用一次，每15天使用一次，最好配合使用有机复合肥，这样效果更佳。

3、特种水产养殖（水蛇，甲鱼、虾、鳗鱼、桂鱼、各种热带鱼等），（1）环境处理：放水前一周，用100倍菌液代替石灰均匀喷洒净化环境。放养前3天，用为20万分之一的菌液稀释液泼洒水面，放养后每15天喷洒一次，水质较差的地方应加大浓度，并缩短泼洒间隔时间。（2）调节水质：在每次换水后泼洒菌液稀释液（浓度为20万分之一），可泼在增氧机旁或进水口，通过机器和水流作用扩散有益微生物，以利最短时间分解有害物质，尽快稳定水质。虾类、甲鱼等养殖品种每月泼洒稀释液2-3次，发病季节适当增加用量。

水蛇肉质雪白细嫩，味道鲜美，营养丰富，且有较高的药用和食疗价值，能促进伤口愈合、健肤美容、舒筋活血，被广东、香港、澳门人视为滋补佳品，在广州及珠江三角洲等地有的地方还开设有水蛇食街或水蛇粥城。广东从2003年下半年禁食野生动物开始，其他各种陆上野生蛇类均在禁售、禁食之列，只有人工养殖的水蛇仍在市场出售和在宾馆、酒楼供应食客，但因需要量较大而养殖数量不多导致货源较紧，价格涨高，据预测其售价仍有上升趋势。

水蛇人工养殖技术简单，成本低，发展空间大，市场前景十分广阔。投资8000元建一个小型生态水蛇场，1个劳动力饲养种蛇100组(1公3母为1组)400条，办场第二、第三、第四年的纯收入分别为8144元、1．19万元、5．2万元。以建设与投资效益分析。

水蛇场建设

饲养400条种蛇，需10平方米种蛇池4个、3平方米幼蛇养殖过渡池4个、100平方米商品蛇饲养塘3个、活体饲料生产房1间、水生饲料生产塘1个、蚯蚓养殖场1个。

1．种蛇繁殖池：长4米、宽2．5米、深1．1米，砖水泥结构，池底保持淤泥30厘米厚。

2．幼蛇养殖过渡池：长2米、宽1．5米、深0．6米，砖水泥结构，池底保持淤泥20厘米厚。蛇池可并排建，池底向排水端呈5％坡度倾斜，深处池底有排水孔通向池外排水沟进出水口分别设在长方形养殖池的对角线上。两池之间设有人行道。

3．商品蛇饲养塘：面积100平方米，深1．2米，四周建有1米高的防逃墙。

4．活体饲料生产场地：

①活体饲料生产房1问10平方米，用于生产黄粉虫和EM活菌制剂；

②50平方米小池塘1个，用于生产水生饲料；

③在池塘边建一个50～70平方米的蚯蚓养殖场。

第四篇：多重耐药菌的实验室检测

多重耐药菌的实验室检测

近年来，国际上陆续报道“超级细菌”引起感染病例报道引发公众的极度关注，多重耐药菌也成为医院感染重要的病原菌。为此，卫生部发布《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南（试行）》，指导医疗机构通过强化多种耐药菌医院感染的管理，做好多重耐药菌所致感染的预防和控制。

《指南》要求医务人员合理使用抗菌药物，避免因药物使用不当导致细菌耐药的发生。要求临床微生物实验室至少每半年向全院公布一次临床常见分离细菌菌株及其药敏情况，定期向临床医师提供最新的抗菌药物敏感性总结报告和趋势分析，提高临床抗菌药物处方水平。

多重耐药菌（Multidrug-Resistant Organism,MDRO）,主要是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌。常见多重耐药菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）、产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）细菌、耐碳青霉烯类抗菌药物肠杆菌科细菌（CRE）（如产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶[NDM-1]或产碳青霉烯酶[KPC]的肠杆菌科细菌等）、耐碳青霉烯类抗菌药物鲍曼不动杆菌（CR-AB）、多重耐药/泛耐药铜绿假单胞菌（MDR/PDR-PA）和多重耐药结核分枝杆菌。

临床微生物实验室耐药菌的监测工作，是多重耐药菌感染预防与控制工作的前提，因此，临床微生物室必须做好多重耐药菌检测试验的标准化工作，为临床多重耐药菌感染预防与控制提供准确的依据。现将2010年CLSI标准中有关MRSA、VRE、ESBLs、肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的检测标准发给各临床微生物实验室，仅供参考。

产NDM－1细菌的实验室诊断包括筛查、表型确认和基因确证三个步骤。

（一）表型筛查。

在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法（K－B法）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查，如果达到以下标准，需要进行性表型确认。厄他培南特异性较低，不推荐用于筛查试验。

1.K－B法：美洛培南（10μg纸片）或亚胺培南（10μg纸片）抑菌圈直径≤22mm。

2.MIC测定法：美洛培南MIC≥2mg/L时；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC≥2mg/L。

（二）表型确认

双纸片协同实验：采用亚胺培南（10μg）、EDTA（1500μg）两种纸片进行K－B法，两纸片距离10－15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南扩大，即可判定产金属酶。

采用亚胺培南（美洛培南）/EDTA复合纸片，进行K－B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值≥5mm；亚胺培南（美洛培南）/EDTA复合E试条协同实验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值≥8时，即可判定产金属酶。

（三）基因确证

采用NDM－1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带balNDM-1基因。各医院对阳性结果须加以复核，同时将菌株送有条件的参考实验室进一步检测确证。

第五篇：pcr检测技术

《食品安全学》综述

PCR快速检测技术综述

1．前言

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，是肉眼能直接观察和判断；可从一根头发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几个星期才能做到的事情，用PCR几个小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

该酶促反应最基本的3个环节是：[1]模板DNA的变性，即在94℃下模板双链DNA变为单链DNA；[2]引物与模板链的特异性复性；[3]引物链的延伸。

2.研究的目的与意义

聚合酶链反应（PCR）技术建立以来，定性技术不断改进和完善，可以达到检测单个靶序列的水平、但实际工作中常需要定量检测标本中核酸，而不是某一特定序列存在与否，借助PCR对基因快速、敏感、特异而准确定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。定量PCR旨在评估样品中靶分子数，此测定可以是绝对的，如每微克样本中靶DNA的分子数；也可以是相对定量，即与设定的内参照或外参照比较而言。鉴于PCR方法主要有5个，即对PCR产物的直接定量、极限稀释法、靶基因与参照基因的同步扩增、竞争性PCR和荧光定量PCR[1]。这几种放啊各有利弊，对其选择取决于靶基因的特性、对PCR产量的期望值、对准确度的要求、需要相对还是绝对定量。

人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。3.国内外研究现状

3.1.基础研究方面的应用

目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：

[1] 扩增目的基因和鉴定重组子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表达调控的研究； [4]基因组测序； [5]制备单链模板； [6]致突变；

3.2.PCR在临床上的应用[2]

[1]在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。

[2]在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。[3]在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3．3.在法医学中的应用[3]

例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将4.相关检测技术 4.1.技术原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温下也能发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。4.2.工作原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 4.3.工作步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度 5.研究方案

医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类，其分别代表几代实验诊断技术。60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现，70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展。特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，使医学界真正兴起了基因诊断技术热，成为现代医学发展的又一里程碑。用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别，有其自己的特色。一般在样品处理上，多采用非离子去污剂一次加热处理，这种方法对DNA纯化有限，但适应临床微量、快速的特点。另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中，既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会，具有极高的使用价值。本公司率先研制并推出单管单人份的PCR诊断试剂，具有开创性意义。这些改进都不影响PCR效果，同样表现出高特异性、高敏感性、简便快捷等PCR最优秀的特征，在常见传染病、性病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、优生优育、法医学等广泛领域中有相当高的实际应用价值。5.1研究方法

① 早期诊断，因为PCR扩增极其敏感，理论上可检出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潜伏期即可被PCR法检出。

② 对低持续感染乙肝病人的诊断，有些乙肝病人体内的病毒长期低复制感染，血清病毒浓度极低，一般酶标试剂无法检出，可以用PCR法检出。

③ 疗效跟踪及病程判断，因为PCR能半定量检测乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其数量多少的最直接指标。在治疗过程中通过监测血清或白细胞中病毒基因存在与否及其动态变化即能准确地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的浓度很低，丙肝病毒的分离尚未成功。目前用于丙肝病毒检验的方法主要是ELISA法测定血清中的HCV抗体。由于HCV尚无法分离纯化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，这些人工抗原与天然病毒抗原有一定的区别，理论上是存在假阳性或假阴性。同时血清中抗体的出现及动态变化与病人病情无线性相关关系。RT－PCR技术使这些困难得到解决。HCV是RNA病毒，需先将病毒RNA逆转录为cDNA（RT）后再进行PCR扩增，这种技术称之为逆转录－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以检测出血清中低浓度的病毒，了解病毒在体内复制的动态状况。RNA纯化要求严格，是RT－PCR的技术关键，本公司目前使用的高效基因释放剂，联合特异性固相基因吸附乳胶颗粒，对样本中的RNA进行分离纯化，使这一问题得到解决。通常用于RNA→cDNA逆转录的酶大致可以分为二大类，即低温逆转录酶，如AMV/MLV逆转录酶，高温逆转录酶，如Tth酶。Tth酶在锰离子作用下，具有逆转录酶活性，Tth酶活性温度高，可以使核酸充分线性化，提高逆转录效率及特异性。Tth酶在镁离子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，从而真正实现单管单酶单人份的扩增要求，这样就在不降低扩增敏感性的条件下，一步完成扩增，不仅简化操作，而且又减少污染，提高检测的准确性。国内本公司已采用这种技术推出单管单酶单人份的RT－PCR诊断试剂。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，与乙型肝炎病毒协同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人粪便样本中，戊型肝炎病毒也长期存在于血清中。在PCR检测时，需注意取材的合理性。在消化道传染性疾病中，另一类最重要的感染性疾病是幽门螺旋杆菌（HP）所引起的胃炎、胃溃疡等。HP可以经口－口途经传播并定位于胃粘膜上皮细胞，早期表现为浅表性胃炎，可发展成为胃溃疡。我国胃炎发病率之高估计比乙型肝炎更严重，对HP的检测应受到广大医务工作者的重视。对HP的检测可以用生化法测试尿素酶或用免疫法测试血清中对HP特异性抗体，也可对胃液、胃粘膜样本进行细菌培养及菌种鉴定。PCR法检测HP非常敏感且特异性高，有研究发现可以从病人的唾液或口腔含漱液中检出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，减少病人痛苦，5.2.技术路线

PCR技术

聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。5.3.所用仪器与材料

引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40-60%,浓度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。

4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究内容

PCR技术的出现对法医学的发展也有不可低估的作用。在法医物证如血斑、毛发、组织碎片等的确证，DAN多态性分析远比血清学或等方法确实可靠。早期DNA多态性分析主要使用Southern印迹杂交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌红基因第一个内含子中的串联重复序列作探针，从人的基因库中筛选出小卫量DNA，使用阿交法产生杂交图谱即DNA指纹。这一技术成功地应用于个人识别及亲子鉴定。这种方法仍受到样本量的限制，当样本DNA数量不足时或DAN严重降解则不能正常检出。且杂交技术常使用同位素杯记探针要求较镐的防护措施。PCR技术的出现，可以对极少量物证如一根毛发、一滴血液、极小精斑都可以进行分析。在人类基因组中有许多由10-15bp核心顺序构成的串联重复DNA序列，具有单位点特征的称为VNTR结构，多位点串联成为卫星DNA。6．1.检测对象

常见的传染性疾病有细菌、病毒、衣原体、支原体等，可引起消化、呼吸、循环、泌尿生殖等不同系统相应的病变。消化系统感染性疾病在我国具有代表性意义的有肝炎、胃炎及肠道感染性疾病。引起肝炎的病原体主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它还有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。这几种肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均为RNA病毒。我国是乙肝高发区，乙肝病人为世界乙肝病人总数的50％。[4]乙肝病毒经血液传播，病毒主要在肝细胞中增殖，也可以长期存留在骨髓细胞或外周血白细胞中。通常用PCR法检测血清中的乙肝病毒。有报道用PCR法可以在泪液、乳汁、精液及血白细胞中检出乙肝病毒，这些发现提示其它传染途经存在的可能 6．2检测内容

PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。

PCR技术类型[5]

免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术

复合PCR技术

彩色PCR技术

抗原捕获PCR技术 增敏PCR技术

酶标PCR技术

二温式PCR技术

锚定PCR技术

定量PCR技术

毛细管PCR技术

多重PCR技术

巢式或套式PCR技术 7.预期目标PCR 技术在大肠杆菌O157: H7检测中

（1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物： 正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld。

徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7。

4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中

传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。

参考文献

[1] 葛忠源;荧光定量PCR检测DPV弱毒免疫鸭消化道和呼吸道大肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌及其数量变化规律的研究[D];四川农业大学;2006年

[2] 徐焕宾,贲昆龙,曾涛,李劲光;检测HIV-1载量的荧光实时定量PCR技术的建立及其应用[J];中国病毒学;2001年02期

[3] 顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志[J]，1999，3:31-35 [5] 石岚;实时定量PCR检测IgH基因重排的研究[D];昆明医学院;2004年 [6] 王颖.食品安全学技能训练.2010.10